silac用于蛋白質組學定量

1、SILAC定量蛋白質組學,SILAC定量蛋白質組學,1：SILAC定量蛋白質組學原理2: 應用 2.1：SILAC定量蛋白質組學 2.2: SILAC研究蛋白質相互作用 2.3：SILAC研究蛋白質與DNA相互作用 2.4：SILAC研究蛋白質與RNA相互作用,1：SILAC定量蛋白質組學原理,1.1：SILAC定量蛋白質組學的原理1.2：SILAC技術流程 1.2.1：培養(yǎng)基準備

2、 1.2.2：細胞標記與測試 1.2.3: 實驗處理 1.2.3：蛋白質分離與質譜分析 1.2.4：結果形式,SILAC法。 1、標記：在缺乏Lys和Arg的培養(yǎng)基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C6 15N4)、Arg(13C6,或13C6 15N4)等培養(yǎng)細胞，使蛋白質被標記成“中型”或“重型”； 2、細胞處理，如藥物處理； 3、細胞裂解、提取蛋白質； 4、等量混合對照

3、與處理組蛋白質、SDS-PAGE電泳、染色； 5、割取蛋白質條帶，胰蛋白酶消化，質譜分析。,1.1：SILAC定量蛋白質組學原理,1.1：SILAC定量蛋白質組學原理,技術優(yōu)勢——目前比較蛋白質組學最先進方法 （1）高效性：SILAC是體內標記技術，標記效率可高達100%； （2）定量精確：線性范圍廣，降低由于樣品制備不同而造成的實驗內差異； （3）高通量、靈敏度高：可同時鑒定并定量數(shù)百至數(shù)千種蛋白質，且檢可

4、測測到納克級水平； （4）相容性：可以對多種在DMEM或RPMI 1640培養(yǎng)基中能夠培養(yǎng)的細胞或細菌中表達的蛋白進行標記； （5）靈活性：在缺乏L-賴氨酸和L-精氨酸的培養(yǎng)基中添加同位素標記的這兩種氨基酸，操作方便。,1.2.1：培養(yǎng)基準備,材料： （1）：Lys或（和）Arg缺陷型1640培養(yǎng)基， Lys或（和）Arg缺陷型DMEM培養(yǎng)基。 （2）：透析FBS。 （3）：穩(wěn)定同位素標記的Lys和Ar

5、g。L-Lysine(13C6), L-Lysine (13C6,15N2), L-Lysine(13C6,15N2), L-Lysine(15N2,D9), L-Lysine(4,4,5,5-D4) ,L-Arginine(13C6), L-Arginine (13C6, 15N4), L-Arginine(13C6,15N4)。培養(yǎng)基制備： 取相應量的穩(wěn)定同位素氨基酸Lys和Arg各50mg,添加到500ml培養(yǎng)基中

6、，同時添加血清（一般是10%）和抗生素后，0.22um濾膜過濾，4度保存?zhèn)溆?。根?jù)實驗的需要，可以配制“中”型和“重”型培養(yǎng)基。,1.2.2：細胞標記與測試,標記： 一般細胞經過添加同位素的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)5-6代后，一天或2天傳代一次，細胞中蛋白質的Lys和Arg將被同位素氨基酸取代。添加了穩(wěn)定同位素（“中”或“重”型）的細胞與“輕”型細胞相比細胞生長速度可能偏慢，這是由于透析血清與中缺乏一些鹽成分，可以讓透析血清在PBS里

7、面透析，透析膜的孔徑一般為10KDa.標記測試： 在進行正式實驗之前，需要對細胞進行標記測試，測試細胞中蛋白質的Lys和（或）Arg是否被相應的同位素氨基酸取代。收取 蛋白質后，等量混合，SDS-PAGE分離，LC-MS/MS檢測。,1.2.2：細胞標記與測試,細胞經過傳代培養(yǎng)7天后，同一肽段被“重”型肽段取代,1.2.3: 實驗處理,當標記測試檢測到蛋白質已被同位素氨基酸標記后，可以進行細胞處理，如藥物處理，病

8、毒處理等。,1.2.3：蛋白質分離與質譜分析,（1）：提取“輕”型”，“中”型，“重”型細胞蛋白質，等量混合，SDS-PAGE分離，染色。（2）：割取蛋白質條帶，胰蛋白酶酶切。（3）：LC-MS/MS（儀器：LTQ Orbitrap XL?)分析，數(shù)據(jù)檢索。,1.2.4：結果形式,LC-MS/MS分析結果，將會給出每個肽段的質譜峰圖及定量信息。結果將會已EXCEL表格呈現(xiàn)。 肽段質譜峰圖及表達量：,2: SILAC應用,2.1

9、：SILAC定量蛋白質組學實例 2.2: SILAC研究蛋白質相互作用 2.3：SILAC研究蛋白質與DNA相互作用 2.4：SILAC研究蛋白質與RNA相互作用,2.1：SILAC定量蛋白質組學實例,2.1 Schematic for SILAC,SILAC實驗流程圖,2.1 MS spectra showing the four major patterns of phosphorylation observed,SILAC定

10、量結果圖例，質譜峰的高度表示蛋白表達的相對強度,. Summary of fold change with Her2 for all 462 proteins, with several individual proteins high-lighted. Proteins with a ratio>1.5(upperred line) are consideredas increased in their tyrosine

11、 phosphorylation level,and those with ratios<0.66 (lowerred line) are considered as decreased in their tyrosine phosphorylation level. In3T3-Her2cells,198 proteins showed significant increases in phosphorylation,

12、and 81 proteins showed a significant decrease,2.1 Quanti?cation of phosphorylation by SILAC,2.1 Conclusion,2.2 SILAC研究蛋白質與蛋白質相互作用,J. Cell Biol. Vol. 183 No. 2 223–239，2008,2.3 SILAC研究蛋白質與DNA相互作用,Genome Res. 2009 19: 284-