多發(fā)子宮肌瘤與單發(fā)子宮肌瘤雌激素受體α、β差異表達(dá)及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　子宮肌瘤是最常見的婦科良性腫瘤，盡管大多數(shù)肌瘤沒有臨床癥狀，但仍有25％的肌瘤患者表現(xiàn)出一系列的癥狀，包括異常子宮出血、盆腔疼痛、尿頻、不孕及自然流產(chǎn)等。子宮肌瘤是子宮切除的一個常見原因，已成為主要的公眾健康問題，造成了極大的社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　子宮肌瘤是一種多基因多因素疾病。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，子宮肌瘤的發(fā)生存在家族和種族易感性。有研究表明，較早的月經(jīng)初潮和肥胖可增加罹患子宮肌瘤的風(fēng)險。另外，諸如吸煙、攝入紅肉

2、、高血壓、子宮感染等其他一些因素對子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。
　　臨床及實驗證據(jù)表明子宮肌瘤是雌激素依耐性腫瘤，雌激素通過雌激素受體（estrogen receptor, ER）α和β促進(jìn)子宮肌瘤的生長。雖然多發(fā)子宮肌瘤與單發(fā)子宮肌瘤均來源于子宮肌層，且均表現(xiàn)出雌激素依耐性、相對緩慢的生長速率、缺乏侵襲和轉(zhuǎn)移能力等特性，但也表現(xiàn)出一定的差異，多發(fā)子宮肌瘤發(fā)病年齡較小并與多種遺傳綜合征相關(guān)，單發(fā)子宮肌瘤手術(shù)摘除后很少復(fù)發(fā)。這些現(xiàn)象

3、提示，可能存在不同的機(jī)制引起共同的子宮平滑肌細(xì)胞反應(yīng)，使子宮肌瘤呈現(xiàn)多發(fā)和單發(fā)?；谧訉m肌瘤的雌激素依耐性，我們推測組織局部雌激素及其受體的差異表達(dá)可能是導(dǎo)致子宮肌瘤呈現(xiàn)多發(fā)和單發(fā)的原因之一。
　　目的：
　　本研究旨在分析與雌激素密切相關(guān)的雌激素受體、與雌激素信號通路存在相互作用的絲裂原活化蛋白激酶（ mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路以及雌激素受體的靶基因 c-Jun、c

4、-Myc、cyclin D1在多發(fā)與單發(fā)子宮肌瘤中差異表達(dá)，探討多發(fā)與單發(fā)子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，并摸索建立子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞有限細(xì)胞系的方法，為從細(xì)胞層面進(jìn)一步深入研究打下基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.收集2013年8月至2015年2月期間重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科子宮肌瘤手術(shù)切除標(biāo)本35例，其中多發(fā)子宮肌瘤20例，單發(fā)子宮肌瘤15例。一部分標(biāo)本液氮保存，凍存在-80℃，用于組織RNA、蛋白的提取，一部分標(biāo)本4%多聚甲醛

5、固定，用于組織切片、免疫組化。詢問所有患者診斷子宮肌瘤的年齡、月經(jīng)初潮年齡、孕次、產(chǎn)次、距離上次生產(chǎn)的時間，以及子宮肌瘤相關(guān)臨床癥狀，包括腹部隆起、月經(jīng)過多、痛經(jīng)、腹部墜漲、下腹疼痛。根據(jù)體重和身高計算體重指數(shù)（Body mass index，BMI）。根據(jù)末次月經(jīng)時間（Last menstrual period， LMP）和子宮內(nèi)膜病理檢查計算月經(jīng)周期。術(shù)前根據(jù)超聲報告和橢球體公式計算子宮體積。ELISA檢測多發(fā)和單發(fā)子宮肌瘤組織中雌

6、二醇（E2）濃度。Real-Time PCR檢測多發(fā)和單發(fā)子宮肌瘤組織ERα和ERβ mRNA表達(dá)，并分析 ERα和 ERβ mRNA表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。Western Blot和免疫組織化學(xué)檢測多發(fā)和單發(fā)子宮肌瘤組織 ERα和 ERβ蛋白表達(dá)。
　　2.收集2013年8月至2015年2月期間重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科子宮肌瘤手術(shù)切除標(biāo)本35例，其中多發(fā)子宮肌瘤20例，單發(fā)子宮肌瘤15例。一部分標(biāo)本液氮保存，凍存在-80℃

7、，用于組織RNA、蛋白的提取，一部分標(biāo)本4%多聚甲醛固定，用于組織切片、免疫組化。Western Blot和免疫組織化學(xué)檢測多發(fā)和單發(fā)子宮肌瘤組織 p44/42 MAPK和phospho-p44/42 MAPK蛋白表達(dá)。
　　3.收集2013年8月至2015年2月期間重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科子宮肌瘤手術(shù)切除標(biāo)本35例，其中多發(fā)子宮肌瘤20例，單發(fā)子宮肌瘤15例。一部分標(biāo)本液氮保存，凍存在-80℃，用于組織RNA、蛋白的提取，

8、一部分標(biāo)本4%多聚甲醛固定，用于組織切片、免疫組化。Real-Time PCR檢測多發(fā)和單發(fā)子宮肌瘤組織c-Jun、c-Myc、cyclin D1 mRNA表達(dá)。Western Blot和免疫組織化學(xué)檢測多發(fā)和單發(fā)子宮肌瘤組織c-Jun、c-Myc、cyclin D1蛋白表達(dá)。
　　4.收集2013年8月至2015年2月期間重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科子宮肌瘤手術(shù)切除標(biāo)本，用酶消化法和組織塊法分別分離提取子宮肌瘤原代平滑肌細(xì)胞，

9、并進(jìn)行傳代培養(yǎng)、凍存及復(fù)蘇。通過細(xì)胞免疫組化和細(xì)胞免疫熒光，對培養(yǎng)至第4代后的子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞采用肌動蛋白α-SMA的抗體及平滑肌細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白 Desmin的抗體進(jìn)行純度鑒定。采用透射電鏡觀察培養(yǎng)至第4代后的子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞和子宮肌瘤組織的超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：
　　1.患者的平均年齡、體重指數(shù)、平均最大肌瘤直徑、平均子宮體積、首次診斷肌瘤的平均年齡、平均月經(jīng)初潮年齡、平均孕次、平均產(chǎn)次、距離上次生產(chǎn)的平均時間、腹

10、部隆起發(fā)生率、月經(jīng)過多發(fā)生率、痛經(jīng)發(fā)生率、腹部墜漲發(fā)生率、腹部疼痛發(fā)生率等臨床指標(biāo)在多發(fā)與單發(fā)子宮肌瘤組之間均無統(tǒng)計學(xué)差異。E2濃度在多發(fā)子宮肌瘤組明顯低于單發(fā)子宮肌瘤組。ERα mRNA和蛋白表達(dá)在多發(fā)子宮肌瘤組顯著低于單發(fā)子宮肌瘤組，ERβ mRNA和蛋白表達(dá)在多發(fā)子宮肌瘤組顯著高于單發(fā)子宮肌瘤組。ERα蛋白陽性表達(dá)見于多發(fā)和單發(fā)子宮肌瘤組織細(xì)胞核和細(xì)胞漿，ERβ蛋白陽性表達(dá)僅見于多發(fā)和單發(fā)子宮肌瘤組織細(xì)胞核。多發(fā)子宮肌瘤組中，ER

11、β mRNA表達(dá)與子宮體積呈負(fù)相關(guān)（r=-0.555, P＜0.05)，與月經(jīng)過多呈正相關(guān)(r=0.482, P＜0.05)，相關(guān)性均具有統(tǒng)計學(xué)差異。單發(fā)子宮肌瘤組中，ERα mRNA表達(dá)與月經(jīng)過多(r=-0.557, P＜0.05)及初潮年齡(r=-0.525, P＜0.05)呈負(fù)相關(guān)，ERβ mRNA表達(dá)與首次診斷子宮肌瘤的年齡(r=0.524, P＜0.05)及產(chǎn)次(r=0.541, P＜0.05)呈正相關(guān)，相關(guān)性均具有統(tǒng)計學(xué)差異

12、。
　　2.無論是不考慮月經(jīng)周期，還是增生期和分泌期，細(xì)胞核中的phospho-p44/42 MAPK與p44/42 MAPK比值在多發(fā)子宮肌瘤組顯著低于單發(fā)子宮肌瘤組。
　　3.無論是不考慮月經(jīng)周期，還是增生期和分泌期，多發(fā)子宮肌瘤組中c-Jun、c-Myc、cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著低于單發(fā)子宮肌瘤組。c-Jun、c-Myc、cyclin D1陽性表達(dá)均見于多發(fā)和單發(fā)子宮肌瘤組織細(xì)胞核。
　　4.

13、當(dāng)使用酶消化法分離提取細(xì)胞時，細(xì)胞懸液接種24-48h后，大多數(shù)細(xì)胞貼壁并開始增殖，剛開始呈星形或小梭形，隨后胞體漸漸變長，呈不規(guī)則三角形或長梭形，細(xì)胞漸漸增多，相互接觸和融合，縱橫交錯，呈渦旋狀或放射狀生長。當(dāng)使用組織塊法分離提取細(xì)胞時，接種組織塊后約25-30天后開始有細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，剛開始呈星形或小梭形，隨著時間延長，爬出細(xì)胞漸漸增多，細(xì)胞不斷增殖，約40天時相互接觸和融合，呈不規(guī)則三角形或長梭形，呈渦旋狀或放射狀生長。培養(yǎng)

14、至第4代后的子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞α-SMA、Desmin均呈陽性表達(dá)。透射電鏡提示子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與子宮肌瘤組織無明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1.子宮肌瘤組織中ERα和ERβ的表達(dá)差異可能是導(dǎo)致子宮肌瘤呈現(xiàn)多發(fā)和單發(fā)的原因所在。單發(fā)子宮肌瘤中ERα mRNA表達(dá)對月經(jīng)過多這一癥狀可能是一種間接的保護(hù)因素，ERβ mRNA表達(dá)在多發(fā)和單發(fā)子宮肌瘤中對月經(jīng)過多這一癥狀可能是一種預(yù)測因素。
　　2.與多發(fā)子宮肌瘤相比

15、，單發(fā)子宮肌瘤中高表達(dá)的 ERα吸收更多的E2，高水平的E2通過高表達(dá)的ERα或者高水平的ERα/ERβ比值促進(jìn)了 phospho-p44/42 MAPK的表達(dá)，從而在子宮肌瘤的增殖中發(fā)揮作用。
　　3.與多發(fā)子宮肌瘤相比，單發(fā)子宮肌瘤中較高水平的 E2促進(jìn)了c-Jun的表達(dá)，同時誘導(dǎo)了c-Myc的表達(dá)，參與子宮肌瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控?？赡苁荅Rα/ERβ比值在多發(fā)與單發(fā)子宮肌瘤E2通過AP-1路徑介導(dǎo)的cyclin D1表達(dá)調(diào)控中發(fā)