納米抗體靶向的納米微泡的制備及其腎癌靶向性驗證.pdf

1、納米微泡可使組織增強顯影，還可在超聲輻照下定向釋放所攜載的藥物和基因，為解決腎癌鑒別診斷和治療所面臨的困難提供了可能。鑒于腎癌相關抗原G250是一種膜蛋白，在絕大多數腎癌高表達而正常腎組織不表達，故可作為納米微泡的靶點。同時，納米抗體體積小、特異性強，作為配體有助于實現靶向納米微泡的小型化。
　　目的：
　　通過免疫駱駝制備能與腎癌相關抗原G250蛋白胞外區(qū)特異性結合的納米抗體，將其與納米微泡連接制備靶向納米微泡，驗證其腎癌

2、靶向性，為下一步開展腎癌的鑒別診斷及靶向治療提供研究基礎。
　　方法：
　　通過瞬時轉染方式將包含G250蛋白胞外區(qū)基因片段的質粒導入到真核細胞HEK293F中表達G250胞外區(qū)，以該重組蛋白免疫新疆雙峰駝，構建噬菌體展示納米抗體庫。通過體外定向篩選，得到能與G250蛋白胞外區(qū)特異性結合的噬菌體，以Monoclonal phage ELISA方法篩選出具有結合活性的噬菌體克隆。通過細胞ELISA和流式細胞實驗再次驗證淘選到的

3、納米抗體的細胞結合活性。制備空白納米微泡，采用生物素-親和素技術將G250納米抗體連接于納米微泡之上。通過免疫熒光驗證靶向納米微泡構建是否成功。流式細胞實驗鑒定786-O、HeLa和ACHN三種細胞G250抗原表達情況;通過觀察納米微泡與細胞的結合情況評估納米微泡的靶向性。
　　結果：
　　通過測序證實編碼G250的重組DNA片段序列正確，Western blot實驗證實G250重組蛋白成功表達。通過免疫新疆雙峰駝，成功構建

4、了庫容為2.87×109的噬菌體展示駱駝VHH免疫文庫。在體外對免疫納米抗體庫進行了3輪固相篩選，使具有結合活性的噬菌體克隆得到了有效富集，陽性率高達54.3％。經過抗原ELISA、細胞ELISA鑒定，篩選出3個具有細胞結合活性的納米抗體噬菌體克隆，取其中結合活性最高的Nb-G5進行表達、純化，產量為1.5mg每升培養(yǎng)物。流式細胞實驗證實Nb-G5對G250表達陽性的細胞具有很強的特異性結合能力。免疫熒光結果表明靶向納米微泡構建成功，細