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文檔簡介
1、組織因子(TF)作為凝血途徑的始動因子以為人所熟知。在血管損傷后,TF和凝血因子VIIa(FVIIa)形成復(fù)合物激活凝血蛋白酶的瀑布反應(yīng),導(dǎo)致纖維蛋白沉積和血小板的活化。另外,在許多疾病如敗血癥,動脈粥樣硬化和腫瘤,血管中TF的異常表達(dá)會引起致命的血栓形成。近年來研究表明,血管中的TF在產(chǎn)生凝血蛋白酶和后續(xù)激活蛋白酶激活受體(PARS)中也發(fā)揮著非止血作用。這些TF依賴性的信號通路促進(jìn)了一系列生物進(jìn)程,包括炎癥,腫瘤轉(zhuǎn)移和細(xì)胞遷移。本課
2、題組前期研究的EGFP-EGF1蛋白具有TF特異性和高度的親和力,且將其連接于聚乙二醇-聚乳酸-聚羥基乙酸納米粒(PLGA)納米粒表面后構(gòu)建的EGFP-EGF1-PLGA納米粒也具有TF靶向性。
小干擾RNAs(siRNA)通過完全互補(bǔ)的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)介導(dǎo)特異性切割,并有針對性的破壞靶基因的mRNA,從而產(chǎn)生靶基因的mRNA序列特異基因沉默效應(yīng)。它們已被證明能有效下調(diào)人類細(xì)胞中的基因表達(dá),從而具有治療疾病的潛
3、力。然而,siRNA分子本身帶負(fù)電荷,易于被血清中的核酸酶降解,容易被腎臟清除,并無靶向分布能力,這些都導(dǎo)致它難以到達(dá)作用的靶細(xì)胞。它的應(yīng)用受到如穩(wěn)定性差,半衰期短,和沉默效率低等許多限制。因此,siRNA作為RNA干擾(RNAi)的一種手段,其治療最為主要的障礙是缺乏有效的遞送系統(tǒng)。病毒遞送系統(tǒng)如慢病毒、腺病毒,可有較高的轉(zhuǎn)染效率,但由于其致突變性,載藥量有限,以及引起炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答等安全隱患而受到限制。因此,直接的系統(tǒng)性的非病毒
4、載體是siRNA的最佳選擇,該載體應(yīng)具有運(yùn)載核酸類分子如基因,siRNAs,或反義RNA等進(jìn)入細(xì)胞的能力。非病毒遞送系統(tǒng)包括siRNA的化學(xué)修飾,脂質(zhì)體,納米粒,多肽和靶向遞送。隨著合成材料和納米技術(shù)的發(fā)展,可以合成具有特殊功能的納米材料。其在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用變得普遍。納米材料因其具有低毒性,良好的生物降解性和生物相容性,而被用作轉(zhuǎn)染載體,如殼聚糖,聚乙烯亞胺(PEI),聚乳酸-聚羥基乙酸(PLGA),磁性納米粒和納米碳管等。因?yàn)榭梢缘?/p>
5、抗高核酸酶并具有粘膜粘附特性,使得它們成為siRNA重要的載體。靶向 RNAi治療是一個(gè)相對新的研究領(lǐng)域,它可以滿足體內(nèi)遞送要求的選擇靶向性。靶向病變細(xì)胞,器官或組織可以提高一定siRNA劑量下的基因沉默效率。特異性的細(xì)胞靶向功能還可以抑制siRNA對非病變細(xì)胞造成的副作用。通過具有高度特異性和親和力的抗體,短肽和其他配體連接于載體表面可以介導(dǎo)siRNA到達(dá)靶向組織和細(xì)胞。
前期研究采用復(fù)乳法制備的EGFP-EGF1-PLGA
6、納米粒,適合包載水溶性的基因藥物。它不僅對包載的藥物具有保護(hù)作用,還可將其靶向遞送至病變組織或細(xì)胞。鑒于上述基礎(chǔ),本研究將利用該納米粒作siRNA或shRNA的載體,靶向遞送至病變細(xì)胞,發(fā)揮基因沉默效應(yīng)。由于前期的研究都是基于大鼠模型的疾病進(jìn)行,而有些疾病模型在小鼠中更為經(jīng)典,為了拓寬該納米粒的應(yīng)用范圍,本研究還驗(yàn)證了ENP在小鼠高表達(dá)TF的疾病模型(動脈粥樣硬化模型)中的靶向性。
第一部分 載組織因子siRNA的EGFP-E
7、GF1蛋白結(jié)合聚乙二醇-聚乳酸-聚羥基乙酸納米粒的構(gòu)建及表征
目的:篩選出有效的大鼠組織因子特異性的siRNA片段(TF-siRNA);將該片段載入EGFP-EGF1蛋白結(jié)合聚乙二醇-聚乳酸-聚羥基乙酸納米粒(PEG-PLGA)中,并對該納米粒的性質(zhì)進(jìn)行鑒定。
方法:選擇大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系C6來篩選siRNA片段,細(xì)胞表面天然表達(dá)TF,通過傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑lipo2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(Q-PCR)和west
8、ern-blot檢測細(xì)胞組織因子的mRNA和蛋白水平改變,進(jìn)而篩選出最佳的TF-siRNA片段。
采用復(fù)乳法,合成出包載TF-siRNA的PLGA納米粒(TF-siRNA-NP),之后將EGFP-EGF1蛋白巰基化,連接于TF-siRNA-NP表面,合成出TF-siRNA-ENP。通過粒徑/Zeta電位測定儀對納米粒的粒徑和 Zeta電位進(jìn)行測定。通過普通電鏡觀察納米粒的形態(tài),并通過免疫電鏡觀察納米粒表面連接的蛋白。提取納米粒
9、中的siRNA計(jì)算siRNA的載藥量和包封率。通過體外釋放實(shí)驗(yàn)計(jì)算出siRNA的釋放量。
結(jié)果:siRNA-638片段為大鼠組織因子最佳沉默片段。載入TF-siRNA的ENP(TF-siRNA-ENP)粒徑大小約100nm左右,外觀大小均一、圓整。Zeta電位為-11mV左右。免疫電鏡結(jié)果證實(shí)納米粒表面連接有EGFP-EGF1蛋白。TF-siRNA的包封率約81.33%。體外不同pH環(huán)境中siRNA的釋放無明顯差異,6小時(shí)內(nèi)快
10、速釋放約42%。
結(jié)論:TF-siRNA-ENP粒徑大小,EGFP-EGF1蛋白的成功連接,siRNA的載藥量和體外的快速釋放都可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。
第二部分 載組織因子siRNA的EGFP-EGF1蛋白結(jié)合聚乙二醇-聚乳酸-聚羥基乙酸納米粒的靶向性及體外評價(jià)
目的:驗(yàn)證TF-siRNA-ENP對損傷的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMECs)的靶向性。評價(jià)TF-siRNA-ENP對腫瘤壞死因子α(TNFα)誘導(dǎo)的BM
11、ECs損傷過程中,組織因子表達(dá)和組織因子活性的抑制效果。評價(jià)該納米粒的細(xì)胞毒性。
方法:兩次消化加Percoll梯度離心法提取大鼠BMECs,TNFα誘導(dǎo)BMECs的損傷,建立損傷的微血管內(nèi)皮細(xì)胞模型。在ENP納米粒表面連接香豆素-6示蹤納米粒,測定其載藥量等性質(zhì),并進(jìn)行細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn);同時(shí)用對siRNA進(jìn)行標(biāo)記,在BMECs中示蹤siRNA。轉(zhuǎn)染TF-siRNA-ENP進(jìn)入誘導(dǎo)的BMECs,通過實(shí)時(shí)定量PCR,western-
12、blot,和流式檢測TF表達(dá)水平的改變。并通過TF活性檢測評價(jià)其對細(xì)胞TF活性的影響。CCK-8法檢測納米粒的細(xì)胞毒性。
結(jié)果:TNFα誘導(dǎo)損傷的BMECs可以高表達(dá)TF。TF-siRNA-ENP可以更好的被損傷BMECs攝取,介導(dǎo)siRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。有效下調(diào)損傷過程中細(xì)胞TF mRNA和蛋白的表達(dá)水平。并能有效降低細(xì)胞TF的活性。在有效作用劑量下TF-siRNA-ENP對細(xì)胞活性無影響,較lipo2000明顯優(yōu)勢。
13、 結(jié)論:TF-siRNA-ENP是TF-siRNA靶向遞送至損傷內(nèi)皮細(xì)胞的一個(gè)有效遞送系統(tǒng)。它的細(xì)胞安全性好,基因沉默效率高。
第三部分 EGFP-EGF1蛋白結(jié)合聚乙二醇-聚乳酸-聚羥基乙酸納米粒在動脈粥樣硬化模型中靶向性的研究
目的:驗(yàn)證EGFP-EGF1-PLGA納米粒(ENP)對小鼠動脈粥樣硬化模型(AS模型)的靶向性。
方法:通過復(fù)乳法,分別構(gòu)建載香豆素-6和Dir的ENP納米粒。分別測定他們的
14、載藥量。用單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)誘導(dǎo)原代小鼠主動脈平滑肌細(xì)胞(VSMCs),用氧化低密度脂蛋白(oxLDL)誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞(Raw264.7)分別構(gòu)建體外高表達(dá)TF的動脈粥樣硬化細(xì)胞模型。高脂伺料持續(xù)14周喂養(yǎng)ApoE基因敲除小鼠(ApoE-/-),建立小鼠動脈粥樣硬化模型。細(xì)胞攝取載香豆素-6納米粒的實(shí)驗(yàn),通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度,判斷其細(xì)胞靶向性。通過油紅O染色和血清膽固醇脂的測定來驗(yàn)證AS動
15、物模型中粥樣硬化斑塊的形成。載Dir的納米粒進(jìn)行器官成像實(shí)驗(yàn),觀察其體內(nèi)分布;同時(shí)進(jìn)行冰凍切片,激光共聚焦直接觀察納米粒在病變血管中的分布。
結(jié)果:兩種細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)后建立的細(xì)胞模型,均可高表達(dá)TF。ENP納米??梢愿玫谋荒P图?xì)胞所攝取。與不連接EGFP-EGF1蛋白的納米粒之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高脂飲食喂養(yǎng)14周的ApoE-/-小鼠血清膽固醇脂明顯升高,主動脈血管切片中可見內(nèi)膜增厚和脂質(zhì)斑塊的沉積。器官成像結(jié)果顯示AS模
16、型中,斑塊區(qū)域可更好的攝取ENP納米粒。切片結(jié)果顯示ENP在血管中多分布在高表達(dá)TF的部位,并可以部分與斑塊區(qū)域重合。
結(jié)論:ENP具有小鼠AS模型的靶向性。
第四部分 載CCR2-shRNA的EGFP-EGF1蛋白結(jié)合聚乙二醇-聚乳酸-聚羥基乙酸納米粒的體外研究
目的:在體外驗(yàn)證載CC趨化因子2特異性shRNA(CCR2-shRNA)的ENP(CCR2-shRNA-ENP)可以有效下調(diào)AS細(xì)胞模型的CCR
17、2表達(dá),并抑制細(xì)胞的遷移能力。
方法:通過雙重免疫熒光法和實(shí)時(shí)定量PCR檢測AS模型小鼠主動脈內(nèi)CCR2和TF的表達(dá)情況。通過實(shí)時(shí)定量PCR,選擇誘導(dǎo)劑MCP-1和oxLDL最佳的作用濃度及作用時(shí)間點(diǎn),構(gòu)建體外同時(shí)高表達(dá)TF和CCR2的AS細(xì)胞模型。誘導(dǎo)后的細(xì)胞給予CCR2-shRNA-ENP干預(yù),通過實(shí)時(shí)定量PCR和western-blot測定細(xì)胞CCR2表達(dá)水平的改變。同時(shí)用CCK-8法評價(jià)CCR2-shRNA-ENP的細(xì)
18、胞毒性。轉(zhuǎn)染CCR2-shRNA-ENP的細(xì)胞,分別進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn),評價(jià)其對這兩種細(xì)胞遷移能力的改變。
結(jié)果:AS模型小鼠主動脈內(nèi)高表達(dá)TF和CCR2,在14周時(shí)兩者表達(dá)都處于高位。通過Q-PCR結(jié)果選擇MCP-1以10ng/ml作用于VSMCs2h,oxLDL以50μg/ml作用于Raw264.71h,來構(gòu)建細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)染CCR2-shRNA-ENP后的模型細(xì)胞CCR2表達(dá)在mRNA和蛋白水平都有明顯下降。且不影響細(xì)胞活性
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