AAV-2 P5啟動子功能的分子基礎研究.pdf

1、Rep介導的定點整合將AAV基因組插入人類基因組19號染色體的AAVS1位點,該機制用于基因治療研究可以實現(xiàn)目的基因安全長期地表達。用Rep-AAVS1定點整合系統(tǒng)作基因轉(zhuǎn)移時,為克服Rep蛋白的細胞毒性作用,維持Rep蛋白低水平瞬時表達是一個有待解決的問題。驅(qū)動Rep蛋白表達的AAV-2P5啟動子是一個多功能的元件,可作為定點整合的底物以及反饋調(diào)控Rep的表達。P5-Rep表達框架反式提供Rep蛋白可以低水平表達Rep蛋白,但是由于P

2、5啟動子本身是高效的定點整合底物,一方面和順式定點整合元件競爭從而降低帶有目的基因的順式元件的整合效率,另一方面P5-Rep整合進AAVS1位點會使得Rep長期表達造成安全性隱患。本研究試圖通過突變分析來解析P5啟動子定點整合和反饋調(diào)控的分子基礎,嘗試尋找一種可以去掉定點整合功能而保留反饋調(diào)控活性的,具有應用價值的P5啟動子突變體。
　　在P5啟動子內(nèi)核心區(qū)段TATA/RBE/Yyl進行的突變分析顯示,P5 RBE對P5的定點整合

3、效率和有效的反饋調(diào)控能力都是必需的。雖然TATA box和Yyl+1位點的突變會造成P5啟動子定點整合效率嚴重下降(分別只有8.3％和10.4％,野生型P5為34.0％以上),但是前者的突變只引起P5啟動子反饋調(diào)控能力一定程度下降而后者的突變則幾乎不會影響P5啟動子的反饋調(diào)控能力。對P5 RBE內(nèi)的核苷酸進行了更加細致的突變分析發(fā)現(xiàn):P5 RBE中266GAGTGAGC273這一序列內(nèi)單個核苷酸的突變能造成P5啟動子定點整合和反饋調(diào)控R

4、ep蛋白表達兩種功能的分化,其旁側(cè)序列對P5啟動子的功能幾乎沒有影響。該序列內(nèi)的單核苷酸突變造成P5啟動子定點整合能力的劇烈下降,但能保持有效的反饋效率,其中以C273T這一突變體的分化程度最高(6.5％的定點整合效率和76.0％的反饋調(diào)控效率)。體外Rep-P5RBE結(jié)合實驗觀察到P5啟動子的反饋調(diào)控能力主要依賴于Rep-P5RBE之間的親和力強弱,而其定點整合于AAVS1的能力不只是與Rep-P5RBE之間的親和力有關(guān),還存在其他的

5、因素。這些因素中,很可能包括P5RBE中266GAGTGAGC273這一序列本身的同源性。
　　上述P5啟動子結(jié)構(gòu)-功能上關(guān)系的研究結(jié)果提示P5啟動子的定點整合和反饋調(diào)控Rep蛋白表達這兩種功能是可以分化的。并為Rep介導的定點整合機制及P5啟動子的反饋調(diào)控機制的進一步完善,提供了新的視角和觀點。而在基于Rep介導的定點整合基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中,用C273T這一P5啟動子的突變體反式提供Rep蛋白是一個很好的選擇,它可以安全的提供瞬時、