人類iNOS基因啟動子-1026C-A多態(tài)的功能研究.pdf

1、前言
　　 一氧化氮合酶包括:神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)。其中,iNOS在正常生理狀態(tài)下不表達或表達量極低,只有誘導(dǎo)后才大量表達,因此iNOS基因表達調(diào)控對NO的產(chǎn)生至關(guān)重要。iNOS基因在原發(fā)性高血壓發(fā)生中發(fā)揮重要作用,一方面iNOS可通過產(chǎn)生NO引起血管平滑肌細胞舒張降低血壓,另一方面還通過NO衍生物一過氧亞硝酸鹽陰離子(ONOO-)發(fā)揮促高血壓作用。

2、>　　 本課題組前期研究中,通過高血壓高發(fā)區(qū)連鎖分析發(fā)現(xiàn)17號染色體上的微衛(wèi)星D17S1878與高血壓存在連鎖。進一步病例.對照人群和家系研究證實,iNOS基因啟動子-1026C/A多態(tài)與高血壓發(fā)生相關(guān),其中-1026C等位基因及-1026CC基因型是高血壓發(fā)生的獨立危險因素。此外對iNOS啟動子-1026C/A多態(tài)的初步功能研究發(fā)現(xiàn),-1026位點存在轉(zhuǎn)錄因子YY1反應(yīng)元件,-1026C/A多態(tài)影響了YY1-DNA結(jié)合模式以及iNO

3、S啟動子螢光素酶報告基因重組體p1173C/A-luc的轉(zhuǎn)錄活性,并推測可能繼而通過影響NO的產(chǎn)生導(dǎo)致-1026C/C的高血壓易感風(fēng)險升高。然而,YY1是如何影響iNOS啟動子,-1026C/A多態(tài)對iNOS基因轉(zhuǎn)錄的確切功能,以及多種高血壓相關(guān)因子調(diào)控iNOS轉(zhuǎn)錄活性的效應(yīng)和具體機制尚不明確。
　　 材料與方法
　　 一、實驗材料
　　 1、細胞系:人喉鱗癌細胞(Hep2),人胃癌細胞(BGC823),非洲綠猴

4、腎(COS-7),小鼠巨噬細胞(RAW264.7):
　　 2、載體:螢火蟲熒光素酶報告載體、海腎熒光素酶表達載體、YY1表達及RNA干擾載體、NFIC野生型及突變型表達載體、c-Jun 表達載體、雌激素受體表達載體、糖皮質(zhì)激素受體表達載體、鹽皮質(zhì)激素受體表達載體、p300野生型及突變型表達載體；
　　 3、Western印跡雜交相關(guān)試劑及試劑盒；
　　 4、基因克隆及螢光素酶報告基因檢測相關(guān)試劑及試劑盒；

5、>　　 5、DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合實驗、免疫共沉淀、電泳泳動遷移實驗(EMSA)及染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)相關(guān)試劑及試劑盒；
　　 6、Real-time PCR相關(guān)試劑及試劑盒；
　　 7、細胞刺激因子:細胞因子混合物(IFN-γ、IL-1β和TNF-α)、丁酸鈉、雌二醇、地塞米松、醛固酮、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、胰島素樣生長因子Ⅱ和胰島素。
　　 二、實驗方法
　　 1、iNOS啟動子螢光素酶報告基因載體

6、構(gòu)建及檢測:利用在線軟件進行iNOS啟動子轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測分析,構(gòu)建系列截短的螢光素酶報告基因重組體,應(yīng)用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測啟動子的活性,鑒定iNOS基因關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)；
　　 2、應(yīng)用DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合實驗、免疫共沉淀、EMSA和ChIP方法鑒定iNOS啟動子-1026C/A多態(tài)位點DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物組成,各轉(zhuǎn)錄因子相互作用,及DNA-結(jié)合親和力；
　　 3、共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄因子及激素受體表達載體,應(yīng)用螢光素酶報告基因系統(tǒng)

7、,檢測YY1、NFI和AP-1對iNOS基礎(chǔ)啟動子活性的影響；以及雌二醇、地塞米松、醛固酮、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、胰島素樣生長因子Ⅱ和胰島素在iNOS轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用；
　　 4、Real-time PCR方法檢測YY1、NFI和AP-1過表達對細胞因子混合物誘導(dǎo)后iNOS mRNA表達的影響；
　　 5、丁酸鈉刺激,以及共轉(zhuǎn)染野生型/突變型p300表達載體,檢測乙?；趇NOS表達調(diào)控中的作用。
　　 結(jié)果

8、>　　 1、系列截短的螢光素酶報告基因活性檢測發(fā)現(xiàn)iNOS啟動子-1173bp~-1032bp的141-bp片段可能為負性轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)；含有-1026C/A多態(tài)位點的16-bp片段(-1032 bp～-1016 bp)為iNOS基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵正性調(diào)控區(qū)。
　　 2、轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測分析發(fā)現(xiàn),除YY1外,iNOS啟動子-1026C/A位點還存在另兩個轉(zhuǎn)錄因子NFI和AP-1,DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合實驗顯示,-1026C/A位點存在由YY1

9、,NFI和AP-1組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物,其中YY1與-1026C優(yōu)勢結(jié)合,而NFI與-1026A優(yōu)勢結(jié)合,免疫共沉淀結(jié)果提示AP-1和NFI之間存在相互作用,NFI和YY1之間也可能存在相互作用,而AP-1和YY1之間可能無直接的相互作用。
　　 3、EMSA實驗證實NFI能與-1026A特異性直接結(jié)合,而AP-1與-1026A之間的結(jié)合可能是間接的,ChIP實驗顯示細胞內(nèi)NFI和YY1與含有-1026C/A位點iNOS啟動子結(jié)合

10、,且YY1與-1026C結(jié)合親和力較強,NFI與-1026A結(jié)合親和力較強。
　　 4、通過YY1和NFI過表達及YY1的RNA干擾后檢測p1173C/A-luc和p1032C/A-luc轉(zhuǎn)錄活性,發(fā)現(xiàn)YY1和NFI抑制iNOS基礎(chǔ)啟動子活性,該負性調(diào)控作用受正性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子AP-1的影響；其中,YY1的抑制作用明顯強于NFI。
　　 5、Real-time PCR結(jié)果顯示,細胞因子混合物(IFN-γ、IL-1β和TNF

11、-α)顯著誘導(dǎo)BGC823細胞iNOS表達,YY1、NFI或AP-1單獨過表達對iNOS的誘導(dǎo)表達影響不明顯,而AP-1/NF1或AP-1/YY1聯(lián)合過表達均抑制iNOS的誘導(dǎo)表達,且AP-1/YY1的抑制作用明顯強于AP-1/NF1。
　　 6、轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測分析顯示iNOS基因啟動子1.2 kb序列中還存在一個TATAbox、NF-кB/C/EBP、C/EBP、Sp1以及多個糖皮質(zhì)激素和雌激素反應(yīng)元件；
　　 7、體外

12、培養(yǎng)BGC823、Hep2、COS-7和RAW264.7細胞發(fā)現(xiàn),p1173C/A-luc轉(zhuǎn)錄活性在不同細胞系中差異明顯,而-1026C/A在不同細胞系中均影響iNOS啟動子活性。
　　 8、類固醇激素(雌二醇、地塞米松、醛固酮)刺激及其受體過表達實驗結(jié)果顯示,雌激素下調(diào)p1173A-luc轉(zhuǎn)錄活性依賴于雌激素受體,醛固酮及鹽皮質(zhì)激素受體有上調(diào)p1173A-luc轉(zhuǎn)錄活性的趨勢,而地塞米松及糖皮質(zhì)激素受體對p1173A-luc轉(zhuǎn)

13、錄活性無明顯作用；此外,p1173C-luc轉(zhuǎn)錄活性不受這些激素的影響。
　　 9、應(yīng)用去乙?；敢种苿┒∷徕c刺激,以及乙酰轉(zhuǎn)移酶輔助因子p300的過表達實驗,發(fā)現(xiàn)丁酸鈉處理可顯著降低p1173C-luc和p1173A-luc的轉(zhuǎn)錄活性,且對p1173A-luc的抑制作用較強；而共轉(zhuǎn)染野生型p300后p1173C-luc和p1173A-luc轉(zhuǎn)錄活性無顯著變化；提示由丁酸鈉介導(dǎo)的乙?；揎椏赡芤种苅NOS因的基礎(chǔ)啟動子活性。

14、r>　　 10、應(yīng)用血壓調(diào)節(jié)因子(TGF-β1、IGF Ⅱ和胰島素)處理Hep2細胞后p1173C/A-luc轉(zhuǎn)錄活性均無明顯改變,-1026C/A多態(tài)的作用仍很顯著,提示人iNOS基因1.2 kb啟動子可能不是這些血壓調(diào)節(jié)因子的直接作用靶點。
　　 結(jié)論
　　 1、iNOS啟動子-1026C/A多態(tài)位點所在16-bp片段是基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵調(diào)控區(qū),該位點DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物包括YY1、NFI和AP-1,其中YY1和N

15、FI直接結(jié)合DNA,而AP-1間接結(jié)合DNA；
　　 2、YY1和NFI與-1026C/A位點的結(jié)合親和力存在差異,YY1與-1026C優(yōu)勢結(jié)合,NFI與-1026A優(yōu)勢結(jié)合；
　　 3、YY1和NFI均抑制iNOS基礎(chǔ)啟動子轉(zhuǎn)錄活性,且YY1的作用明顯強于NFI,在細胞因子誘導(dǎo)后,AP-1/YY1對iNOS基因mRNA轉(zhuǎn)錄的抑制效應(yīng)明顯強于AP-1/NFI；
　　 4、iNOS基因啟動子可能存在多個轉(zhuǎn)錄因子反應(yīng)