白介素-1β(IL-1β)、白介素-18(IL-18)及NOD樣受體蛋白3(NLRP3)在痤瘡發(fā)病過程中作用的研究.pdf

1、目的：探討正常人角質(zhì)形成細(xì)胞(Normal human epidermal keratinocytes, NHEK）受到痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes，P.acnes）刺激后白介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)、白介素-18（Interleukin-18, IL-18）的表達(dá)情況，以及NOD樣受體蛋3（Nucleotide-binding oligomerization domain-

2、like receptor containing pyrin domain3, NLRP3）是否參與這個過程，以便我們進(jìn)一步探討?zhàn)畀彽难仔苑磻?yīng)，為痤瘡治療提供一些新的思路。
　　方法：1、提取正常人角質(zhì)形成細(xì)胞及鑒定：從正常人包皮組織（來自于我院激光室）中提取出角質(zhì)形成細(xì)胞，并利用倒置顯微鏡對所分離出的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，利用免疫熒光鑒定所分離出的細(xì)胞，最終確認(rèn)所分離出的細(xì)胞為NHEK。2、按照說明書活化并培養(yǎng)痤瘡丙酸桿菌，挑取經(jīng)鑒

3、定為P.acnes的菌落懸浮于滅菌水中得到細(xì)菌懸浮液，每次現(xiàn)配現(xiàn)用。3、使用不同濃度[最終感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection, MOI）分別為10、20、30]的P.acnes菌懸液分別刺激NHEK12h、24h、36h后采用酶聯(lián)免疫法測定（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)（Real-time quantitative PCR de

4、tecting system, Real-time PCR）檢測IL-1β、IL-18的表達(dá)情況。4、分別用不同濃度的半胱天冬酶-1（Caspase-1）抑制劑z-YVAD-fmk預(yù)處理 NHEK后用 MOI30 P.acnes菌懸液刺激 NHEK36h后采用 ELISA、Real-time PCR檢測IL-1β、IL-18的表達(dá)情況。5、使用NLRP3炎性小體特異性小干擾RNA（Small interfering RNA, siRNA

5、）、不同濃度的抗氧化鈦SS-31、鉀離子通道阻滯劑格列本脲（Glibenclamide, Glib）預(yù)處理NHEK后用MOI30 P.acnes菌懸液刺激NHEK36h后采用免疫印跡法（Western blot, WB）檢測 NLRP3炎性小體的表達(dá)情況，采用ELISA、Real-time PCR檢測IL-1β、IL-18的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1、接種10天左右可見有鋪石路樣細(xì)胞貼壁生長，3-4天進(jìn)行傳代，傳代后約3天長滿。免疫

6、熒光顯示細(xì)胞角蛋白7（cytokeratin7, CK7）、細(xì)胞角蛋白8（cytokeratin8, CK8）陽性，經(jīng)鑒定，所分離出的細(xì)胞即為NHEK。2、P.acnes在37℃的厭氧環(huán)境中孵育48小時后可長出形態(tài)較一致的菌落。3、MOI10、20、30 P.acnes菌懸液按時間梯度12h、24h、36h刺激NHEK后，ELISA法、Real-time PCR法檢測NHEK產(chǎn)生的IL-1β、IL-18值較空白對照組均有不同程度的增加，

7、且增加程度具有時間相關(guān)性，12h開始上升，36h小時達(dá)到最高，統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異（P＜0.05）。MOI30 P.acnes菌懸液組較MOI10、MOI20 P.acnes菌懸液組所產(chǎn)生的IL-1β、IL-18值更高，存在劑量相關(guān)性，統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異（P＜0.05）。4、z-YVAD-fmk預(yù)處理NHEK后，ELISA法、Real-time PCR法檢測NHEK產(chǎn)生的IL-1β、IL-18值較陽性對照組均有不同程度降低，并且隨著藥

8、物濃度的升高，IL-1β、IL-18的降低程度越明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。5、siRNA、SS-31、Glib預(yù)處理 NHEK后， Western blot法檢測NHEK中NLRP3炎性小體的表達(dá)量較陽性對照組有不同程度降低，但仍高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。6、siRNA、SS-31、Gliu預(yù)處理NHEK后，IL-1β、IL-18值較陽性對照組均有不同程度降低，統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異（P＜0.05

9、）。
　　結(jié)論：1、P.ances可以刺激NHEK分泌IL-1β、IL-18，并且具有時間相關(guān)性和劑量相關(guān)性；2、P.ances刺激NHEK分泌IL-1β、IL-18需要NLRP3炎性小體的參與；3、P.ances刺激NHEK分泌IL-1β、IL-18需要caspase-1的參與；4、P.ances刺激NHEK后可以引起NLRP3炎性小體的增多；5、P.ances刺激NHEK分泌NLRP3炎性小體需要鉀離子的外流以及活性氧的參與。