幽門螺桿菌經(jīng)ROS通路激活NLRP3炎癥復(fù)合體誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌IL-1β和IL-18.pdf

1、目的:
　　NLRP3（NACTH domain-leucine-rich repeat,and PYD-containing protein，NLRP3）炎癥復(fù)合體能被多種激活劑所激活?；钚匝?Reactive oxygen species，ROS)是激活NLRP3信號通路的信號之一。本實驗以THP-1（人單核細(xì)胞）來源的巨噬細(xì)胞為模型，觀察幽門螺桿菌（Helicobacter pylori, H. pylori）對NLRP3炎

2、癥復(fù)合體活化的影響及ROS在其中的作用。
　　方法:
　　將THP-1細(xì)胞與H. pylori SS1共孵育，按照不同MOI（感染復(fù)數(shù)）200:1、100:1、50:1、25:1，并于0h、3h、6h、12h、24h收集培養(yǎng)上清及細(xì)胞，ELISA檢測IL-1β和IL-18含量，F(xiàn)CM檢測 ROS的水平，Realtime-PCR檢測 NLRP3、caspase-1（cysteiny aspartate-specific pro

3、tease-1，caspase-1）mRNA水平，Western blot檢測 caspase-1的表達(dá)情況。采用 RNA干擾技術(shù)干擾 NLRP3基因表達(dá)，觀察NLRP3-siRNA對H. pylori誘導(dǎo)的IL-1β和IL-18分泌的影響。用25mM的ROS清除劑 N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）預(yù)處理 THP-1細(xì)胞30min，再按照MOI=100:1加入H. pylori SS1處理，觀察NAC預(yù)處理對

4、H. pylori誘導(dǎo)的NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)以及IL-1β、IL-18分泌的影響。
　　結(jié)果:
　　(1) H. pylori能以時間依賴性和劑量依賴性方式誘導(dǎo) THP-1細(xì)胞產(chǎn)生 IL-1β和IL-18；用MOI為100:1的H. pylori刺激THP-1巨噬細(xì)胞，IL-1β在6h達(dá)到最高，IL-18在12h達(dá)到最高（P<0.05）；當(dāng)MOI為200:1時， IL-1β和IL-18產(chǎn)生水平減少。<

5、br>　　(2) FCM檢測結(jié)果顯示，H. pylori能以時間依賴性方式誘導(dǎo) THP-1細(xì)胞產(chǎn)生ROS，其中于刺激6h達(dá)到高峰（p<0.01）；NAC預(yù)處理可明顯清除H. pylori處理后THP-1細(xì)胞ROS產(chǎn)生（p<0.05），于3h、6h、12h、24h ROS熒光值分別減少6.79％、33.63%、19.59%、14.68%。
　　(3) Realtime-PCR結(jié)果顯示， H. pylori刺激 THP-1細(xì)胞使細(xì)胞

6、NLRP3、caspase-1mRNA表達(dá)均有表達(dá)，NLRP3 mRNA于6h開始升高，12h達(dá)到高峰（p<0.05），caspase-1 mRNA于3h開始升高，12h達(dá)到高峰（p<0.01）；NAC預(yù)處理后NLRP3（p<0.05）、caspase-1（p<0.01）mRNA表達(dá)水平降低。
　　(4) Western blot結(jié)果顯示，H. pylori刺激的THP-1細(xì)胞后caspase-1p10（10KD）的蛋白含量升高，