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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景:
乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)簡(jiǎn)稱乙肝病毒,是一種小環(huán)型部分雙鏈DNA病毒,其基因組至少包含S(包含S基因、PreS1基因和PreS2基因)、C、X、P等4個(gè)開放讀碼框架,分別編碼包膜抗原(HBs)、核心蛋白(HBc)、X蛋白(HBx)和DNA聚合酶。HBV屬于嗜肝病毒屬,但沒有直接的肝細(xì)胞毒性,病毒感染后引發(fā)的免疫性肝損傷是其致病的重要機(jī)制,HBV感染后可進(jìn)一步導(dǎo)致肝硬化或肝細(xì)胞肝癌的
2、發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計(jì),目前全世界HBV感染人數(shù)已超過4億,每年約100余萬人死于HBV相關(guān)肝病,因HBV相關(guān)疾病死亡的人數(shù)占全球40%左右,因此,HBV是目前危害人類健康的主要?dú)⑹种?,但HBV感染致免疫性肝損傷的作用尚不十分清楚,其致病機(jī)制亟待于深入探討。
長(zhǎng)期以來,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為HBV的成功清除與體內(nèi)較強(qiáng)的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答有關(guān),然而,越來越多的證據(jù)表明固有免疫在HBV感染及致病過程中發(fā)揮重要作用,明確HBV感染引發(fā)的免疫效應(yīng)及
3、分子機(jī)制對(duì)于HBV相關(guān)肝病的診斷和治療極為關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn),HBV感染后是由肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞識(shí)別,主要由枯否氏細(xì)胞(Kupffercell,KC)識(shí)別。KC是肝臟中定居的巨噬細(xì)胞,占全身巨噬細(xì)胞總數(shù)的80%-90%,是體內(nèi)最大的巨噬細(xì)胞群,也是肝內(nèi)主要的炎性反應(yīng)細(xì)胞和細(xì)胞因子來源,KC通過產(chǎn)生IL-1β、IL-18等炎癥因子參與各種慢性肝病過程中肝損傷的發(fā)生與發(fā)展。
IL-1β和IL-18的產(chǎn)生依賴于炎性體的激活。炎性體(也稱
4、炎癥小體)是Tschopp等于2002年首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的,第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的炎性體是NLRP1炎性體。隨著研究的深入,陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的炎性體有NLRP3(或NALP3)、NLRC4、AIM2、RIG-Ⅰ炎性體等,其中,NLRP3炎性體被研究得最多,NLRP3分子通過接頭蛋白ASC招募Caspase-1,從而組成多蛋白復(fù)合物即NLRP3炎性體。多種病毒感染可介導(dǎo)NLPR3炎性體的活化,NLRP3炎性體即可感應(yīng)RNA病毒如流感病毒、丙型肝炎病毒(HC
5、V),也可感應(yīng)DNA病毒如腺病毒、水痘-帶狀皰疹病毒,由此說明無包膜的小分子DNA病毒或有包膜的大分子DNA病毒都可調(diào)節(jié)NLRP3炎性體的活化。炎性體的激活可使Caspase-1活化進(jìn)而對(duì)IL-1β或IL-18前體進(jìn)行剪切,促進(jìn)IL-1β或IL-18的成熟和釋放,引起炎癥反應(yīng)。
文獻(xiàn)報(bào)道,IL-18、IL-1β啟動(dòng)子基因多態(tài)性與HBV感染后的疾病進(jìn)程及預(yù)后密切相關(guān),HBx蛋白和HBc蛋白可誘導(dǎo)IL-18的產(chǎn)生,慢乙肝患者血
6、清中IL-1β的水平顯著高于正常人,且乙肝患者體內(nèi)IL-1β的水平與HBV病毒滴度呈正相關(guān)。那么HBV如何調(diào)節(jié)IL-1β和IL-18的產(chǎn)生呢?目前尚未見相關(guān)研究的報(bào)道,本文首次探討了HBV對(duì)NLRP3炎性體的調(diào)節(jié)作用。
T細(xì)胞免疫球蛋白域黏蛋白樣蛋白(T-cellimmunoglobulindomainandmucindomain,Tim)家族是McIntire于2001年發(fā)現(xiàn)并鑒定的與哮喘和過敏性疾病相關(guān)的一個(gè)新基因家族
7、。小鼠Tim基因家族位于染色體1181.1,目前共發(fā)現(xiàn)8個(gè)基因,編碼蛋白Tim-1-Tim-4和4個(gè)假想基因Tim-5-Tim-8。人類TIM家族只有3個(gè)基因,定位于染色體5q33.2,分別編碼蛋白TIM-1、TIM-3、TIM-4。Tim蛋白是一類具有共同基序的Ⅰ型跨膜糖蛋白,其結(jié)構(gòu)包括免疫球蛋白(IgV)樣區(qū)、黏蛋白(Mucin)樣區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。除Tim-4外,Tim-1、Tim-2、Tim-3胞內(nèi)區(qū)均含有酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)
8、,直接參與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
Tim-4分子在免疫調(diào)節(jié)及維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。Tim-4是Tim-1的天然配體,主要表達(dá)在活化的抗原提呈細(xì)胞表面,能維持腹腔巨噬細(xì)胞平衡,Tim-4與Tim-1相互作用可為T細(xì)胞提供協(xié)同刺激信號(hào),Tim-4對(duì)T細(xì)胞的活化具有雙重調(diào)控作用,而Tim-4對(duì)巨噬細(xì)胞具有負(fù)調(diào)控作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),Tim-4過表達(dá)可抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1β產(chǎn)生,在ConA誘導(dǎo)的小鼠肝炎模型中,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)輸Tim
9、-4過表達(dá)的巨噬細(xì)胞系可抑制IL-1β的產(chǎn)生,提示Tim-4可能抑制炎性體的活化。另外,發(fā)現(xiàn)慢乙肝患者PBMCs、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝單個(gè)核細(xì)胞中Tim-4的表達(dá)水平顯著減低,那么HBV如何調(diào)節(jié)Tim-4的表達(dá),是否通過調(diào)節(jié)其啟動(dòng)子活性進(jìn)而影響其表達(dá)呢?HBV是否通過調(diào)節(jié)Tim-4的表達(dá)影響NLRP3炎性體的活性呢?本文基于相關(guān)問題進(jìn)行了初步探討。
研究目的:
明確HBV對(duì)NLRP3炎性體活性的影響,并初步探討
10、其作用機(jī)制;構(gòu)建人TIM-4啟動(dòng)子報(bào)告基因載體并鑒定其活性;探討TIM-4對(duì)NLRP3炎性體活性的影響。
方法:
第一部分:HBV對(duì)NLRP3炎性體活化的影響
1.臨床標(biāo)本檢測(cè)
(1)收集慢乙肝患者及健康對(duì)照血漿標(biāo)本
收集了56例慢乙肝患者的初診病人和20例健康對(duì)照組的肝素抗凝血,離心取上清,-20℃保存。
(2)ELISA檢測(cè)血漿中IL-1β的水平
11、r> 利用ELISA試劑盒檢測(cè)初診的慢乙肝病人以及健康對(duì)照組的血漿中IL-1β的水平。
2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
(1)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠及正常對(duì)照
取鑒定為陽性的8-12周齡的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(Balb/c)35只,以及由山東大學(xué)動(dòng)物中心提供的12只同齡Balb/c小鼠為正常對(duì)照。
(2)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清DNA及抗原的檢測(cè)
分批處死HBV轉(zhuǎn)基因小鼠,摘眼球取血,室溫放置
12、2h,4℃離心收取上清,檢測(cè)HBVDNA及表面抗原。
(3)ELISA檢測(cè)血清中IL-1β的水平
用ELISA試劑盒檢測(cè)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠與健康對(duì)照鼠血清中的IL-1β。
(4)Westernblot檢測(cè)小鼠肝組織中Caspase-1的活化
隨機(jī)選取14例HBV轉(zhuǎn)基因小鼠及正常對(duì)照小鼠的肝組織,取米粒大小的肝組織,勻漿并提取蛋白,Westernblot檢測(cè)Caspase-1的活化情況
13、。
3.細(xì)胞模型
(1)Caspase-1、ASC、NLRP3siRNA的篩選與鑒定
分別設(shè)計(jì)并合成了人ASC、caspase-1、NLRP3三個(gè)基因的小干擾套餐,在HEK293細(xì)胞中用質(zhì)粒DNA與小干擾用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn),轉(zhuǎn)染48h后,收取細(xì)胞,提蛋白,用Westernblot驗(yàn)證干擾效果,選取效果較好的進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí),利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染PMA誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞,驗(yàn)證以上基因siRNA對(duì)內(nèi)源性基
14、因的干擾效果。
(2)HepG2.2.15或HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激THP-1細(xì)胞
常規(guī)培養(yǎng)HepG2或HepG2.215細(xì)胞(無G418),待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶即將傳代時(shí),收取其上清,1.5mlEp管分裝并凍存于-80℃,避免反復(fù)凍融。
THP-1細(xì)胞以4-5×105/ml的密度接種于24孔板,分別加入200μl的HepG2或HepG2.215細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激0h、3h、24h或48h,加上清前
15、吸取出等量的培養(yǎng)基,以保持相同的培養(yǎng)體系。輕輕晃動(dòng)細(xì)胞板混勻,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24h,離心收取上清及細(xì)胞。
(3)HepG2.2.15或HepG2細(xì)胞與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)
利用corningtranswell小室,THP-1細(xì)胞以4×105/ml的密度接種于12孔板下室,HepG2.2.15/HepG2細(xì)胞鋪于上室。THP-1細(xì)胞數(shù)目固定,設(shè)THP-1/HepG2或HepG2.215細(xì)胞分別
16、為1∶1、1∶2和1∶4三個(gè)比例,共培養(yǎng)48h后收細(xì)胞及上清。
(4)ELISA檢測(cè)IL-1β的水平
同上檢測(cè)上清中IL-1β的水平。
(5)細(xì)胞免疫熒光觀察HBV促NLRP3炎性體的形成
HepG2或HepG2.215細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激48h后,收集細(xì)胞,以4%多聚甲醛固定,以兔抗人Caspase-1、NLRP3單克隆抗體為一抗、Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行免疫熒光染色,熒光
17、顯微鏡觀察紅色熒光,拍照保存。
4.NLRP3炎性體重構(gòu)實(shí)驗(yàn)
(1)NLRP3炎性體重構(gòu)體系的建立
參考文獻(xiàn)建立NLRP3炎性體重構(gòu)系統(tǒng),將HEK293細(xì)胞、HepG2、HeLa、Huh7細(xì)胞分別接種于24孔培養(yǎng)板,利用Lipofectin2000共轉(zhuǎn)染以下質(zhì)粒DNA,質(zhì)粒及其用量分別為:pDsRed-monomer-C1-humanASC5ng、pDsRed-monomer-C1-humanc
18、aspase-15ng、pCR4-TOPO-humanNLRP315ng、pDsRed-monomer-C1-humanIL-1beta150ng,混勻后共轉(zhuǎn)細(xì)胞,轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞的培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染5-6h換成含血清的培養(yǎng)基。48h后收取細(xì)胞及其上清,ELISA檢測(cè)上清中IL-1β,提取蛋白Westemblot檢測(cè)Caspase-1的活化情況。
(2)HBV質(zhì)粒DNA與NLRP3炎性體共轉(zhuǎn)
在HEK2
19、93、HepG2、HeLa、Huh7細(xì)胞中分別進(jìn)行共轉(zhuǎn)染,NLRP3炎性體組分質(zhì)粒DNA用量同上,分別同時(shí)轉(zhuǎn)入pcDNA3.0或pcDNA3.0-HBV1.1質(zhì)粒DNA600ng,轉(zhuǎn)染48h后收取細(xì)胞及其上清。
(3)ELISA檢測(cè)IL-1β的水平
收取細(xì)胞上清,用eBioscience公司的humanIL-1βELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β。
(4)Westernblot檢測(cè)Caspase-1
20、的活化
24孔板轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后,收細(xì)胞,提取蛋白,Westernblot檢測(cè)Caspase-1的活化情況。
(5)ASC表達(dá)載體的構(gòu)建及過表達(dá)穩(wěn)篩細(xì)胞系的建立
a.構(gòu)建真核載體pc3-hASC-HA,以pDsRed-monomer-C1-hASC載體為模板,以加了HA標(biāo)簽的下游引物來擴(kuò)增hASC-HA基因片段,雙酶切后連入pcDNA3.0載體。經(jīng)測(cè)序并比對(duì)無誤后的的重組載體經(jīng)WesternBl
21、ot驗(yàn)證。
b.HEK293細(xì)胞最佳G418的篩選濃度:將HEK293細(xì)胞稀釋到1000個(gè)細(xì)胞/ml,分別加入G418,使其終濃度為400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml,隔1-2天換含相同G418濃度的培養(yǎng)基,兩至三周后觀察結(jié)果,HEK293細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度即為最佳篩選濃度。
建立ASC過表達(dá)穩(wěn)篩細(xì)胞系:HEK293細(xì)胞鋪板后,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pDsRed-mon
22、omer-C1-humanASC,轉(zhuǎn)染48h后換成含800μg/mlG418的培養(yǎng)基,隔1-2天換液。穩(wěn)篩兩周后,熒光顯微鏡觀察,提取蛋白Westernblot檢測(cè)ASC的表達(dá)。
(6)共培養(yǎng)體系驗(yàn)證HBV可能通過Rac1激活NLRP3炎性體
THP-1細(xì)胞以4×105/ml的密度種板,用320nMPMA(12-16h)誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞后,Rac1小干擾干擾24h后,再與HepG2.2.15細(xì)胞共培養(yǎng)48h后E
23、LISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中的IL-1β水平。
第二部分:人TIM-4啟動(dòng)子報(bào)告基因載體的構(gòu)建及檢測(cè)
(1)人TIM-4啟動(dòng)子系列載體的構(gòu)建
利用軟件預(yù)測(cè)并分析了人TIM-4基因的啟動(dòng)子-1887/+65,并根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)系列截短的啟動(dòng)子。
以健康人外周血PBMC基因組DNA為模板,利用高保真酶PCR擴(kuò)增出人TIM-4基因啟動(dòng)子區(qū)域-1887至+65(轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為+1)片段,
24、膠回收PCR產(chǎn)物連T載體,藍(lán)白斑篩選等鑒定陽性克隆,經(jīng)SacⅠ、XhoⅠ雙酶切連入經(jīng)相同酶切的pGL3載體,轉(zhuǎn)化、涂板、雙酶切、測(cè)序鑒定陽性克隆。
以載體pGL3-humanPTIM4(-1887/+65)為模板,構(gòu)建-1682/+65、-1307/+65、-1162/+65、-887/+65、-662/+65、-392/+65、-162/+65、-42/+65等截短的啟動(dòng)子。
(2)啟動(dòng)子活性檢測(cè)
25、 雙熒光素酶法檢測(cè)分析報(bào)告質(zhì)粒人TIM-4啟動(dòng)子的活性。A549細(xì)胞以2×105個(gè)/ml的密度鋪于48孔板,以啟動(dòng)子質(zhì)粒DNA500ng/孔、pGL-TK10ng/孔利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48h,吸掉培養(yǎng)基,PBS洗三遍,以1×PBL細(xì)胞裂解液徹底裂解細(xì)胞,用熒光計(jì)數(shù)儀檢測(cè)啟動(dòng)子的熒光素酶活性與內(nèi)參pGL-TKRenilla熒光素酶活性,比較其ratio值。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3復(fù)孔,取平均值。
第三部分:TIM-4對(duì)NL
26、RP3炎性體活性的影響
(1)NLRP3炎性體重構(gòu)
同上重構(gòu)NLRP3炎性體,利用脂質(zhì)體法分別同時(shí)轉(zhuǎn)入pcDNA3.0或pcDNA3.0-TIM-4600ng,轉(zhuǎn)染48h后收細(xì)胞及其上清,檢測(cè)IL-1β的水平。
(2)小鼠TIM-4系列表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
構(gòu)建小鼠TIM-4全長(zhǎng)及不同結(jié)構(gòu)域缺失的系列載體:pEGFP-Mtim-4(fulllength)、pEGFP-mTIM-4(
27、△C)(胞內(nèi)區(qū)缺失)、pEGFP-mTIM-4(△TC)(跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)缺失)、pEGFP-mTIM-4(△TC)-DAF(跨膜區(qū)以人DAF跨膜區(qū)代替),分別以PCR、酶切、測(cè)序鑒定序列的正確性。轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況。
結(jié)果:
第一部分:HBV對(duì)NLRP3炎性體活化的影響
1.HBV感染導(dǎo)致IL-1β升高
慢乙肝患者(初診)及HBV轉(zhuǎn)基因小鼠外周血中IL-1β
28、水平顯著高于正常對(duì)照(p<0.05),但并未發(fā)現(xiàn)其與HBVDNA及抗原的相關(guān)性。
2.HBV促單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β
共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著HepG2.2.15細(xì)胞數(shù)目的減少,IL-1β的產(chǎn)生也隨之降低。
HepG2細(xì)胞或HepG2.2.15上清處理THP-1細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)含HBV上清呈時(shí)間依賴性刺激IL-1β的產(chǎn)生,HepG2.2.15細(xì)胞上清也可顯著刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生IL-1
29、β。
3.HBV促單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β依賴于Caspase-1
THP-1細(xì)胞用Caspase-1抑制劑處理1-1.5h后,進(jìn)行HepG2.2.15上清處理48h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Caspase-1抑制劑處理組IL-1β水平顯著低于DMSO對(duì)照組。
4.HBV促IL-1β產(chǎn)生是通過NLRP3炎性體發(fā)揮作用
4.1.驗(yàn)證小干擾效果
利用質(zhì)粒DNA或siRNA共轉(zhuǎn)染HEK
30、293細(xì)胞、siRNA轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞,Westernblot檢測(cè)驗(yàn)證Caspase-1、ASC、NLRP3siRNA的干擾效果,結(jié)果顯示siNLRP3-978、2545可顯著抑制NLRP3蛋白的表達(dá);siASC-217、397、499均具有干擾效果;siCaspase-1-788、1094干擾效果較好。
4.2.NLRP3在HBV誘導(dǎo)的IL-1β產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用
THP-1細(xì)胞(5×105/ml)接種于
31、12孔培養(yǎng)板,以終濃度為320nmol/ml的PMA誘導(dǎo)12-16h貼壁,轉(zhuǎn)染前換成無血清的培養(yǎng)基,用Lipo2000轉(zhuǎn)siNLRP3-9785μl/孔,6-8h換成含10%血清的培養(yǎng)基,干擾24h后,加入HepG2.2.15細(xì)胞與之共培養(yǎng)48h收細(xì)胞及其上清,結(jié)果表明:與對(duì)照組相比,干擾NLRP3后HBV誘導(dǎo)的IL-1β水平顯著降低。
5.HBV促進(jìn)NLRP3炎癥小體組裝
5.1.NLRP3炎性體重構(gòu):參考
32、相關(guān)文獻(xiàn),利用HEK293/HepG2/Hela/Huh7細(xì)胞重構(gòu)NLRP3炎癥小體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:共轉(zhuǎn)染pcDNA3-HBV1.1可顯著促進(jìn)IL-1β的產(chǎn)生,與對(duì)照組相比,Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示HBV可促進(jìn)Caspase-1的活化。
5.2.HBV促進(jìn)NLRP3炎性體的形成:含HBV上清刺激THP-1細(xì)胞48h,免疫熒光檢測(cè)NLRP3、Caspase-1分子的表達(dá),利用熒光顯微鏡觀察,結(jié)果顯示HBV刺激組表達(dá)
33、水平上調(diào)。
5.3.ASC過表達(dá)穩(wěn)篩細(xì)胞系的建立:利用HEK293細(xì)胞確定G418的有效作用濃度為800μg/ml,pDsRed-express-C1-ASC及空載體pDsRed-express-C1分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,并利用含800μg/mlG418培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,待細(xì)胞克隆形成后進(jìn)行傳代,利用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)篩選的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光,Westernblot可檢測(cè)到ASC蛋白的表達(dá)。
5.4.真核表達(dá)
34、載體pcDNA3.0-humanASC-HA的構(gòu)建:陽性克隆分別利用PCR及酶切、測(cè)序鑒定,PCR可擴(kuò)增ASC特異性片段,經(jīng)HindⅢ、XbaⅠ酶切鑒定,測(cè)序結(jié)果經(jīng)blast分析序列與genebank提供的人ASC基因序列完全一致。pcDNA3.0-humanASC-HA質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后,利用HA抗體可檢測(cè)到其蛋白的表達(dá)。
6.HBV通過Rac1激活NLRP3炎性體
THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)
35、貼壁,轉(zhuǎn)染RaclsiRNA及對(duì)照24h,再用含HBV的HepG2.2.15細(xì)胞與之共培養(yǎng)48h,ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示Rac1干擾組IL-1β水平低于對(duì)照組。
第二部分:人TIM-4啟動(dòng)子報(bào)告基因載體的構(gòu)建及檢測(cè)
成功構(gòu)建人TIM-4啟動(dòng)子報(bào)告基因的全長(zhǎng)及系列截短載體,啟動(dòng)子活性待驗(yàn)證。
第三部分:TIM-4對(duì)NLRP3炎性體活性的影響
NLRP3炎性體重構(gòu)體系中,過表達(dá)TIM-
36、4可顯著抑制IL-1β的產(chǎn)生。
成功構(gòu)建了小鼠TIM-4的不同功能域缺失的載體pEGFP-mTIM4(fulllength)、pEGFP-mTIM4(△C)、pEGFP-mTIM4(△TC)、pEGFP-mTIM4(△TC)-DAF,轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后,于熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光。
結(jié)論:
1.利用慢乙肝病人及HBV轉(zhuǎn)基因小鼠證實(shí)HBV可促進(jìn)IL-1β的產(chǎn)生,提示其產(chǎn)生與炎性體激活有關(guān)。
37、> 2.利用THP-1細(xì)胞證實(shí)HBV誘導(dǎo)IL-1β的產(chǎn)生依賴于Caspase-1。
3.利用THP-1細(xì)胞及重構(gòu)實(shí)驗(yàn)證實(shí)HBV通過激活NLRP3炎性體誘導(dǎo)IL-1β的產(chǎn)生。
4.HBV通過Rac1通路激活NLRP3炎性體。
5.TIM-4抑制NLRP3炎性體的活化。
創(chuàng)新點(diǎn)及意義:
本研究首次發(fā)現(xiàn)HBV通過激活NLRP3炎性體誘導(dǎo)Caspase-1的活化及IL-
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