銀杏抗逆基因的克隆和人胸腺肽植物生物反應(yīng)器的研究.pdf

1、本研究從銀杏中首次克隆了一個(gè)防御素基因GbD，全長(zhǎng)為534bp，包含一個(gè)240bp的編碼框ORF，編碼80個(gè)氨基酸殘基的蛋白。預(yù)測(cè)蛋白的等電點(diǎn)和分子量分別是9.05和5.68kDa。蛋白序列比對(duì)分析表明，GbD蛋白同其它抗病植物防御素有很高的相似性，特別是與裸子植物白云杉防御素的序列更為相似77％。蛋白特征分析表明，GbD具有典型的植物防御素特征，N端有30個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。與絕大多數(shù)植物防御素蛋白一樣，GbD同樣具有位置高度保守的8個(gè)

2、半胱氨酸殘基。三維模型分析表明，GbD能形成與煙草中抗菌植物防御素(NaD1)高度相似的蛋白折疊，一個(gè)α-螺旋和由三條β-折疊形成的保守的CSα/β結(jié)構(gòu)，并通過(guò)4個(gè)二硫鍵穩(wěn)定?；钚晕稽c(diǎn)的氨基酸特征分析表明，GbD包含同其它抗真菌性的植物防御素類似的活性位點(diǎn)序列特征，富含帶電荷氨基酸，而且具有電荷性更高。這些分析表明編碼一個(gè)植物防御素基因，而且可能具有同其它植物防御素類似的抗菌作用?；蚪MSouthern雜交分析表明，GbD屬于一個(gè)小的基

3、因家族?；虮磉_(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在機(jī)械損傷和甲基茉莉酸處理后GbD基因的表達(dá)升高，表明GbD可能與脅迫抗性有關(guān)。已經(jīng)構(gòu)建GbD基因的植物表達(dá)載體，得到了經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的煙草和番茄植株，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的進(jìn)一步研究可以幫助對(duì)GbD基因功能更全面深入的了解。 從銀杏中克隆了一個(gè)新的脫落酸、脅迫和成熟誘導(dǎo)基因Asr(abscisicacid，stressandripening)。GbAsr基因的全長(zhǎng)952bp，包含一個(gè)543bp的編碼框，編

4、碼181個(gè)氨基酸的蛋白。蛋白富含His，Lys，GluandAla。多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)GbASR和其它植物中的ASR具有很高的相似性。系統(tǒng)發(fā)生樹分析發(fā)現(xiàn)，GbASR與松樹的ASR蛋白更相似，這可能是因?yàn)樗鼈兌际锹阕又参锏脑?。Southernblot分析發(fā)現(xiàn)，GbAsr屬于一個(gè)小的基因家族。RT-PCR分析表明用甘露醇、NaCl和ABA處理以后，在根、莖和葉片中GbAsr的表達(dá)明顯增加。利用pET-32a載體成功的在大腸桿菌中表達(dá)了GbASR

5、重組蛋白，分子量大小為20kDa，與軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果吻合。 根據(jù)植物偏愛(ài)密碼子人工合成了84bp的胸腺肽α1(thymosinalphal,Tα1)全基因序列，然后把4個(gè)基因串連起來(lái)，使用p35S強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)盒。采用強(qiáng)啟動(dòng)子和植物偏愛(ài)密碼子以及增加拷貝數(shù)，有利于目的基因的高效表達(dá)。并在載體上設(shè)計(jì)了兩個(gè)左右T-DNA邊界，篩選基因nptⅡ和胸腺肽基因分別位于不同的T-DNA區(qū)，以便實(shí)現(xiàn)篩選基因和目的基因的分離。經(jīng)過(guò)酶切、PCR擴(kuò)

6、增和測(cè)序證明，胸腺肽基因正確的構(gòu)建到了雙邊界組成型表達(dá)載體p35S-2300-two-T-DNA-4×Ta1中。載體轉(zhuǎn)化煙草以后，同時(shí)PCR擴(kuò)增胸腺肽基因和nptⅡ基因，在所有的再生植株中都能檢測(cè)到nptⅡ基因，但是只有35％左右的植株檢測(cè)到胸腺肽基因，這個(gè)結(jié)果初步表明，雙邊界載體上的兩個(gè)T-DNA區(qū)在進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的時(shí)候，可以實(shí)現(xiàn)目的基因和標(biāo)記基因的分別整合。所以本研究構(gòu)建的雙邊界載體是實(shí)現(xiàn)Make-free轉(zhuǎn)基因植物的有效方法，可以容

7、易篩選分離出不含抗性基因的后代植株，有利于產(chǎn)品的推廣應(yīng)用和生態(tài)安全。Southern雜交的結(jié)果表明胸腺肽基因已經(jīng)整合到部分植株的基因組中。 另外采用番茄果實(shí)特異啟動(dòng)子PG和油菜油體基因啟動(dòng)子OP作為胸腺肽基因的啟動(dòng)子，分別構(gòu)建了番茄果實(shí)特異表達(dá)載體PG-PRD12-4×Ta1-TP和油菜油體特異表達(dá)載體OP-2300-two-T-DNA-OG。在番茄果實(shí)中表達(dá)胸腺肽基因，可以解決口服的問(wèn)題，同時(shí)有利于消除組成型啟動(dòng)子對(duì)植物本身的