轉基因雞生物反應器生產人瘦素蛋白的研究.pdf

1、瘦素(leptin)是肥胖基因(obese gene，ob基因)的產物，具有抑制攝食、調節(jié)脂肪沉積與能量代謝的功能。Leptin的作用除與肥胖有關外，對多種生理過程都有調節(jié)作用，諸如生熱作用、免疫系統(tǒng)調節(jié)作用、青春期的始動作用、生殖功能等。重組人leptin蛋白對于部分肥胖以及l(fā)eptin缺乏的個體或脂肪萎縮性糖尿病患者具有一定的療效。 本研究擬通過體外克隆人瘦素蛋白基因，進行體外表達和生物學活性檢驗并構建重組人瘦素蛋白基因的輸

2、卵管特異性載體，定位表達重組人瘦素蛋白的思路，旨意探索建立活體雞生物反應器生產純天然藥用蛋白的體系探索、新思路。主要研究如下： 1.本實驗通過提取人白色脂肪組織總RNA，根據發(fā)表文獻設計一對特異性引物，RT-PCR法擴增人瘦素蛋白基因OB，并定向克隆至pMD19-T載體進行序列分析。結果：與GenBank發(fā)表的人瘦素蛋白基因CDS(登錄號：NM000230)的同源性為100％，說明所擴增的序列為本實驗所要的。 2.通過雙

3、酶切克隆的人肥胖基因的質粒pMD19-T human leptin，獲得人OB基因ORF，定向克隆至原核表達載體PGEX-6P-1，構建重組表達質粒PGEX-OB。經酶切、PCR鑒定和DNA序列檢測正確后，轉化至E.coli BL21中，構建工程菌株BL21-PGEX-OB。37℃培養(yǎng)，經IPTG誘導后，人瘦素融合蛋白以包涵體形式高效表達。SDS-PAGE分析結果顯示，工程菌株BL21-PGEX-OB正確表達了重組人瘦素融合蛋白，所表達

4、的融合蛋白分子為20 KD，大小與理論值相符；IPTG誘導6h，誘導劑IPTG濃度在1mmol/L時，融合蛋白具有最高表達量。Genetool分析結果顯示，目的蛋白最大表達量達菌體蛋白總量的30％。 3.雙酶切克隆的人肥胖基因的質粒pMD19-T human leptin，獲得人ob基因，定向克隆至真核表達載體pcDNA3.0，構建重組人瘦素真核細胞表達載體pcDNA-OB，在3T3細胞中表達重組人瘦素蛋白，并通過小鼠減肥實驗來

5、檢測人瘦素蛋白生物學活性。RT-PCR結果顯示，轉染重組質粒的細胞成功表達人瘦素蛋白；注射重組質粒pcDNA-OB小鼠體重與陰性對照組相比明顯下降，統(tǒng)計分析顯示差異極顯著(P<0.01)，說明重組人瘦素蛋白具有生物學活性。 4.以克隆的人肥胖基因的質粒pMD19-T human leptin，設計帶有特異酶切位點的引物，PCR擴增獲得具有相應酶切為點的OB基因，定向克隆至輸卵管特異性表達載體POV3，經酶切、PCR鑒定和DNA序