臍帶基質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定及其向生殖細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目的:傳統(tǒng)理論均認(rèn)為人卵母細(xì)胞是不可再生細(xì)胞，免疫、環(huán)境、遺傳等多種因素及婦科腫瘤的疾病進(jìn)展、治療過程均可損害卵母細(xì)胞、導(dǎo)致卵巢功能明顯降低，甚至衰竭，喪失生育功能，在神經(jīng)、骨骼、內(nèi)分泌等多方面影響女性的身心健康。這一類患者即使通過輔助生殖技術(shù)也無法獲得有功能的卵子。因此，獲得再生卵母細(xì)胞，是真正有助于解決這類患者無法生育及恢復(fù)其生殖-內(nèi)分泌功能的重要途徑。
　　近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞具備發(fā)育全能性，在一定條件下于體內(nèi)或體

2、外均可誘導(dǎo)分化為功能細(xì)胞。有關(guān)胚胎干細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn):胚胎原始生殖細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)及體內(nèi)移植可產(chǎn)生有功能的卵母細(xì)胞和精子，并成功生育子代。但胚胎干細(xì)胞無法做到自體移植，取材不便、有致瘤性等諸多問題使其研究受到限制。因此，人們將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向成體干細(xì)胞。其中臍帶基質(zhì)干細(xì)胞(Umbilical cord mesenchymal stemcells，UCMSCs)，來源于新生兒臍帶，不需要任何侵入性的過程就可以在廢棄的臍帶當(dāng)中獲取它，不存在倫理學(xué)爭

3、議等優(yōu)勢(shì)，均使其成為再生卵母細(xì)胞的重要種子來源。根據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞具有分化為卵母樣細(xì)胞的潛能，可表達(dá)原始生殖細(xì)胞標(biāo)記物，且能在卵巢局部存活并生長。但均尚未獲得功能性配子。究其原因，與體外使用卵巢卵泡液等誘導(dǎo)方式尚無法完全模擬體內(nèi)微環(huán)境有關(guān)。
　　研究顯示性腺來源的體細(xì)胞更有助于生殖細(xì)胞分化，且同步化的卵巢體細(xì)胞才能促進(jìn)原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cell，PGCs)進(jìn)一步減數(shù)分裂。由此我們認(rèn)為減數(shù)分裂前期

4、的胚胎卵巢與干細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，有望更好地模擬體內(nèi)卵巢卵子發(fā)生的微環(huán)境，同時(shí)充分利用卵巢細(xì)胞分泌細(xì)胞因子等微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行環(huán)境誘導(dǎo)，可能更有助于觀察卵巢微環(huán)境在卵子發(fā)生中的作用，探索成體干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的可能機(jī)制。因此我們擬對(duì)UCMSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)及鑒定，再與原始生殖細(xì)胞共培養(yǎng)，誘導(dǎo)UCMSCs向卵母細(xì)胞樣細(xì)胞進(jìn)行分化，探索其體外誘導(dǎo)生殖細(xì)胞的可能機(jī)制，為完全卵母細(xì)胞再生的研究提供思路。
　　方法:1.1 UCMSCs的分離

5、培養(yǎng)及鑒定
　　采用機(jī)械分離方法提取新生兒臍帶膠質(zhì)、進(jìn)行剪碎后行組織塊直接貼壁培養(yǎng)UCMSCs，運(yùn)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測UCMSCs的免疫表型，進(jìn)行干細(xì)胞鑒定，將P3代UCMSCs作為種子細(xì)胞。
　　1.2 PGCs的分離培養(yǎng)及鑒定
　　采用機(jī)械分離12.5dpc（days posteoltum，發(fā)現(xiàn)陰栓的當(dāng)天記為0.5dpc）的Balb/c小鼠的胎鼠生殖嵴，剪碎后行組織塊直接貼壁培養(yǎng)PGCs，運(yùn)用AP染色初步鑒定細(xì)胞、

6、運(yùn)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測P3代PGCs的免疫表型，進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　1.3 PGCs的生物學(xué)特性研究
　　取P3代PGCs，細(xì)胞免疫熒光染色，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)等技術(shù)進(jìn)行PGCs的生物學(xué)特性研究。
　　1.4 誘導(dǎo)UCMSCs向原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞(Primordial germ cell-like cells，PGCLCs)分化及鑒定
　　取P3代UCMSCs，實(shí)驗(yàn)組使用PGCLCs誘導(dǎo)培養(yǎng)

7、液培養(yǎng)，對(duì)照組繼續(xù)使用UCMSCs培養(yǎng)液，采取置于37℃，5％ CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，隔日換液，并觀察培養(yǎng)液有無渾濁。及倒置顯微鏡下對(duì)照兩組細(xì)胞形態(tài)變化。運(yùn)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測誘導(dǎo)分化后UCMSCs的免疫表型鑒定。
　　1.5 共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化UCMSCs
　　取PGCLCs+P0代PGCs為實(shí)驗(yàn)組1，P4代UCMSCs+P0代PGCs為實(shí)驗(yàn)組2，P4代UCMSCs+ P4代UCMSCs為對(duì)照組，均利用0.4μm孔徑的Tra

8、nswell小室共培養(yǎng)，置于37℃，5％ CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，隔日換液，并觀察培養(yǎng)液有無渾濁。
　　1.6 Western blot檢測UCMSCs向卵母細(xì)胞分化情況
　　取共培養(yǎng)14d后的UCMSCs進(jìn)行Western blot檢測SCP3表達(dá)情況，評(píng)估其向卵母細(xì)胞的分化情況。
　　1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以(x)±s表示，組間比較采用單因素x2檢驗(yàn)，P＜0.

9、05為差異。
　　結(jié)果:2.1 UCMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定
　　倒置顯微鏡下觀察組織塊貼壁培養(yǎng)3-5天后開始有少量長梭形細(xì)胞爬出，培養(yǎng)7d后細(xì)胞融合達(dá)90％，呈漩渦狀或者平行排列貼壁生長，雜細(xì)胞較少，傳代后細(xì)胞較均一，形態(tài)規(guī)則，呈長梭形，增殖快，常于傳代后2d再次接近融合狀態(tài)。流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測UCMSCs表達(dá)中胚層來源分子CD73及分子CD29，陽性率分別為62.9％、95.5％，表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特征分子CD31，陽性率為0

10、.221％，表達(dá)造血干細(xì)胞系特征分子CD45，陽性率為0.186％，表達(dá)階段特異性胚胎抗原SSEA-1，陽性率為0.946％，符合UCMSCs的特征。
　　2.2 PGCs的分離培養(yǎng)及鑒定
　　倒置顯微鏡下觀察生殖嵴組織塊3-5天開始爬出貼壁細(xì)胞，5-7天細(xì)胞能生長至70％～80％融合，細(xì)胞輪廓清楚，排列緊密，大部分細(xì)胞形態(tài)為核質(zhì)比較大的圓形或者橢圓形細(xì)胞。至80％左右融合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行傳代，傳代后細(xì)胞增殖迅速，常于傳代后3天再

11、次接近融合狀態(tài)。AP染色細(xì)胞持續(xù)陽性，表明為含有堿性磷酸酶活性陽性的胚胎原始生殖細(xì)胞。流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測PGCs表達(dá)階段特異性胚胎抗原SSEA-1，陽性率為92.5％，表達(dá)階段特異性胚胎抗原SSEA-4，陽性率為0.71％，符合小鼠PGCs的特征。
　　2.3 PGCs的生物學(xué)特性研究
　　通過細(xì)胞免疫熒光染色及RT-PCR檢測可發(fā)現(xiàn)，Oct4、Stra8、Vasa、Scp3、Zp3均為陽性表達(dá)，表明我們所培養(yǎng)的PGCs是一

12、種來自小鼠胚胎早期的胚胎生殖細(xì)胞，處于未分化狀態(tài)，而且在體外培養(yǎng)過程中可進(jìn)入減數(shù)分裂Ⅰ期。
　　2.4 誘導(dǎo)UCMSCs向PGCLCs分化及鑒定
　　倒置顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組:經(jīng)過向PGCLCs誘導(dǎo)7d-9d后，開始出現(xiàn)部分核質(zhì)比大的圓形或橢圓形細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞仍然保持長梭形形態(tài)。貼壁培養(yǎng)14d后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)階段特異性胚胎抗原SSEA-1，陽性率為73.83％，且表達(dá)階段特異性胚胎抗原SSEA-3，陽性率為66.66％

13、，對(duì)照組細(xì)胞表達(dá)階段特異性胚胎抗原SSEA-1及SSEA-3，陽性率分別為0.69％、0.45％，證明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞已部分向PGCLCs分化。
　　2.5 Western blot檢測UCMSCs向卵母細(xì)胞分化情況
　　結(jié)果顯示，共培養(yǎng)14d后，實(shí)驗(yàn)組1的SCP3蛋白表達(dá)水平為0.566622±0.008407，實(shí)驗(yàn)組2的SCP3蛋白表達(dá)水平為0.271562±0.041784，對(duì)照組的SCP3蛋白表達(dá)水平為0.130108±0