人胚胎生殖細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定.pdf

1、、 人胚胎生殖細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定摘 要人胚 胎生 殖細(xì) 胞 ( e m b 砂 o n i c g e r m c e l l s ， E Gc e l l s ) 來源于原 始生 殖細(xì) 胞的 多能 性的千細(xì)胞，目 前， 小鼠 和人胚胎干細(xì)胞的 分離培養(yǎng)均取得了 一些重大的 進(jìn)展， 但是有關(guān)人P G C s 發(fā)育分化、 體外分離培養(yǎng)體系及人 E G細(xì)胞檢測(cè)等方面還不是很完善，因 此對(duì)于來源于原始生殖細(xì)胞的 人胚胎生 殖細(xì)胞的 研究仍然

2、具有十分重要的意義。1 . 人胚胎原始生殖細(xì)胞的發(fā)生、 遷移及相關(guān)基因的 表達(dá)。采用 隊(duì)5 染色， 免疫組化 ( O C T 4 和h T E R T ) 染色和R l ’ - P C R( O C T 4 和h T E R T )檢測(cè)， 研究了6 ~1 9周人胚胎生殖靖的 組織結(jié)構(gòu)以 及原始生殖細(xì)胞在遷移中的 形態(tài)學(xué)特征、 變化及基因 ( O C T 4 和h T E R T ) 的表達(dá)。 結(jié)果表明， 人胚胎從第6 周開 始， 生殖靖

3、中 有 O C T 4 的陽(yáng)性細(xì)胞， 但是數(shù)量不多， 第 8 一1 2周， 生殖蠟中表達(dá) O C T 4 的陽(yáng)性細(xì)胞比 較多， 第 1 3周后， 生殖靖中表達(dá)的O C T 4 逐漸減少， 生殖靖中的P G C s 大部分分化;而在6 一巧周時(shí)， h T E R T 都有陽(yáng) 性細(xì)胞的表達(dá)， 而且表達(dá)的陽(yáng) 性細(xì)胞比 較廣泛。2 . 不同培養(yǎng)液對(duì)人原始生殖細(xì)胞原代培養(yǎng)的影響。比 較了7 種培 養(yǎng)液 ( 包括 細(xì) 胞條 件培 養(yǎng) 液) 分離培

4、養(yǎng)人P G C s ， 結(jié) 果 表明K S R 培養(yǎng)液 和S T O 條 件培 養(yǎng)液 適用于P G C s 的 原 代 培 養(yǎng); 用5 種含不同 質(zhì)量濃 度U F 的 培 養(yǎng)液 培 養(yǎng) 人P G C s ，結(jié) 果 顯 示 培 養(yǎng) 液中 添 加1 0 n g / 1 l l L l F 時(shí) ， 原 代P G Cs 出 現(xiàn)的 平 均 集 落 數(shù) 最 多 ， 但 與 添 加5 和1 0 n 的I L L I F 相比 差 異 不 顯 著， 而

5、 與 添 加0 和I n 留 n 1 L L I F 相比 差 異 顯 著。3 .在成功分離培養(yǎng)人E G細(xì)胞后， 對(duì)人 E G細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。以D M E M + 巧 % K S R的 無 血清 培 養(yǎng)體 系 培養(yǎng)， 添 加細(xì) 胞因 子u F ( 1 0n 創(chuàng) 1 l l L ) + bF G F( 4 n g 加 L ) + F o r s k o l i n ( 1 0 卜 M ) ， M E F 作 飼 養(yǎng) 層 ， 成 功 分 離

6、 培 養(yǎng) 后 得 到 人E G 細(xì) 胞 。 實(shí)驗(yàn)共用5 6 例5 一1 9周流產(chǎn)胎兒， 培養(yǎng)得到人E G細(xì)胞共 1 6株， 其中 1 株最高傳至 5 代。通過A K P 染色、 免疫組化染色和即飛 P C R 方法檢測(cè)， 人E G 細(xì)胞特異性表達(dá)A K P 、 O C T 4、S S E A 一 1 、S S E A 一 3 、S S E A 一 4 、 T R A 一 1 一 6 0 、 T R A 小8 1 、C 一 k i t ，

7、 和 h T E R T ，這些研究豐富了 人E G細(xì)胞生物學(xué)特性和檢測(cè)方法。關(guān) 鍵詞: 人; 原始生殖細(xì)胞; 胚胎生 殖細(xì)胞; 胚胎干細(xì)胞; O C T 4 ; h T ER T研究生學(xué)位論文的獨(dú)創(chuàng)性聲明長(zhǎng) 人聲 明:聽呈交的學(xué)歷碩士學(xué)位淪文走我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行 的研究工作及取1 等 約研究結(jié)果;論文中的研究畜 創(chuàng) 居 及結(jié)果是按學(xué)校 《 關(guān)于規(guī)范西北農(nóng) 林科技大 學(xué)研 究生學(xué)術(shù)道德的 暫行規(guī)定》獲 得的 ， 如果 違 反此規(guī)

8、定， 一切后果與法律 責(zé)任均由木人承 擔(dān).盡我所知.除了 文中 特別加以標(biāo)注和致種 知 勺 地方外， 論文中不包 含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的 研究結(jié)果. 也不包 含其他人和自己 本人已 獲得西北農(nóng) 沐科技大學(xué) 或共它 教育 機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的 材料.與我一同工 作的 同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已 在論文的致1 針 中 作了明確的說明并表示了附意研 究 生 簽 名 : 于 ; 叁 終 時(shí) 間 :夕 夠 年 了月川 日導(dǎo)師指導(dǎo)研究

9、生學(xué)位論文的承諾本 人 承 諾 : 我 的 學(xué) 歷 碩 士 研 究 生 ~ 三 魚斷呈 交 的 學(xué) 歷 碩 士 學(xué) 位 論 文 是 在 我指導(dǎo)下獨(dú)立開 展研究工作及取得的研兄結(jié)果， 屬于 我現(xiàn)崗 職務(wù)工作的結(jié)果，并嚴(yán)格按照學(xué) 校 《 關(guān) 于 規(guī)范西北農(nóng)林科技大學(xué) 研完 生學(xué)術(shù)道德的 暫行規(guī)定》 而獲得的研 究結(jié)果.如果 違反學(xué)校 《 關(guān)于 規(guī)范西北農(nóng)林 科技大學(xué) 研究生學(xué)術(shù) 近德的暫行規(guī)定》 ， 我必須接受按學(xué)校有關(guān) 規(guī)定的處罰處理并承

10、擔(dān)相應(yīng)導(dǎo)師連 帶介任， 導(dǎo) 師 二 名 : 攀丫 時(shí) 間 : 夕 。 了 年 鄉(xiāng)月2 夕日關(guān)于其他單 位與人員對(duì)研究生學(xué)位論文使用授權(quán)的說明任何收 存和保管本 論文各種版本的單位和個(gè) 人未 經(jīng) 本論文 作者的 導(dǎo)師 授 權(quán)，不得有 對(duì)不 論文 進(jìn)行復(fù) 制、 修改、發(fā)行、出 租、 改 編 等慢犯著作權(quán)的 行 為， 否 則， 按違背 《 中 華 人民 共和國(guó) 著作權(quán)法》 有關(guān) 規(guī) 定處理 并 追究法 律責(zé)任 ‘經(jīng) 木 論文 作 者的 導(dǎo) 師