HELQ對生殖細(xì)胞分化影響的研究.pdf

1、依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)評估，全球不孕不育的比例已經(jīng)占到育齡夫婦的15％。而其中男性不育患者已經(jīng)占據(jù)人類不孕不育患者總量的一半左右。利用干細(xì)胞結(jié)合基因編輯技術(shù)，建立體外生殖分化疾病模型來研究男性不育疾病的機(jī)制，將會有非常好的應(yīng)用前景。
　　HELQ，名為類似于POLQ的解旋酶(Helicase，POLQ-like)，是一種DNA依賴性的ATP酶及DNA解旋酶，它在DSB(DNADouble-Strand Breaks)以及DNA

2、鏈間交聯(lián)(Inter-strand Cross Link，ICL)的修復(fù)過程中都發(fā)揮著重要作用。HELQ可以直接與RAD51的旁系同源復(fù)合物RAD51B/C/D，XRCC2以及DNA損傷相應(yīng)激酶ATR作用。有研究表明，HELQ功能缺陷的小鼠出現(xiàn)類似唯支持細(xì)胞綜合征(Sertoli Cell Only Syndronie，SCOS)表型，提示HELQ可能在性原細(xì)胞階段或者原始生殖細(xì)胞階段發(fā)揮作用。
　　在本實(shí)驗(yàn)中，通過利用CRISP

3、R-Cas9基因編輯技術(shù)獲得能穩(wěn)定傳代的HELQ敲除的小鼠雄性胚胎干細(xì)胞系(Embryonic stem cell,ES)。免疫熒光染色結(jié)果顯示敲除HELQ后，Oct3/4及Nanog的表達(dá)與對照組相比無明顯差異，利用四倍體補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)證明胚胎干細(xì)胞的多能性不受影響，能夠獲得健康的四倍體小鼠子代。同時(shí)我們利用HELQ敲除的胚胎干細(xì)胞在特定的培養(yǎng)條件下繼續(xù)進(jìn)行體外分化，最終可以得到第二天(Day2)的上胚層類似細(xì)胞(Epiblast Like

4、 cells，EpiLCs)。通過免疫熒光染色及Real-time PCR分析，結(jié)果表明HELQ敲除的胚胎干細(xì)胞分化為上胚層細(xì)胞無明顯異常。說明敲除該基因后不會影響胚胎干細(xì)胞的多能性及定向分化。因此，我們按照體外生殖細(xì)胞分化體系繼續(xù)將上胚層類似細(xì)胞按照生殖細(xì)胞方向分化，通過流式分析可知敲除HELQ后，形成較低比例的Blimp1和Stella陽性細(xì)胞，其比例與對照組相比相差2-3倍，說明HELQ對生殖細(xì)胞的分化具有一定的影響作用。雖然并未