牛蒡子苷元抗肝纖維化作用及抑制肝星狀細胞增殖的分子機制研究.pdf

1、目的：探討牛蒡子苷元（ATG）對四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的防治作用及抑制血小板源性衍生因子BB（PDGF-BB）刺激的肝星狀細胞（HSCs）增殖的分子機制。
　　方法：復(fù)制大鼠CCl4肝纖維化模型，造模8周。從第5周開始，給予ATG和秋水仙堿（colchicine，COL），連續(xù)治療4周。測定各組大鼠血清中肝功能指標和肝纖維化標志物水平，肝組織中羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）的含量；HE和 Mass

2、on染色觀察肝組織病理學(xué)改變，免疫組織化學(xué)法分析肝組織中纖維化相關(guān)蛋白表達情況，并采用組織免疫熒光雙標法檢測活化的肝星狀細胞增殖狀況，免疫印跡法測定細胞周期相關(guān)調(diào)控蛋白的表達水平。采用BrdU摻入的ELISA法，檢測ATG對活化的HSC細胞增殖的抑制效果，并使用流式細胞術(shù)分析ATG對細胞周期進程的影響，免疫印跡法檢測細胞周期相關(guān)蛋白的表達情況；通過免疫共沉淀技術(shù)獲得 Cyclins-CDKs免疫復(fù)合物，并分別以組蛋白H1（histone

3、 H1）和細菌合成的GST-Rb融合蛋白為底物，分別檢測細胞周期素依賴的蛋白激酶CDK2和CDK4/6激酶復(fù)合物的活性；通過特異性的p21cip1和p27kip1抗體，將與p21cip1和p27kip1結(jié)合的CDKs-CKIs免疫復(fù)合物從全細胞裂解液中進行分離后，考察p21cip1和p27kip1與CDK2、CDK4、CDK6的相互結(jié)合情況；為證實ATG所介導(dǎo)的G0/G1周期停滯和HSCs增殖抑制作用，與其上調(diào)p27kip1蛋白表達水平

4、有關(guān)，采用siRNA技術(shù)，特異性地沉默p27kip1基因表達后，同時檢測其對ATG誘導(dǎo)的細胞周期阻滯和細胞增殖抑制作用的影響；通過檢測位于PDGFR下游的FOXOs的磷酸化水平、FOXO3a和14-3-3復(fù)合物形成以及FOXO3a入核情況，考察ATG對PDGF調(diào)控的下游信號分子的影響，探索ATG上調(diào)細胞周期阻抑物蛋白p27kip1表達的信號調(diào)控通路；采用siRNA技術(shù)，特異性沉默F(xiàn)OXO3a基因表達，檢測其對ATG誘導(dǎo)上調(diào)的p27kip

5、1表達水平的影響。
　　結(jié)果：研究ATG對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的治療作用，結(jié)果顯示，給予ATG（1、3mg/kg）和COL（0.1 mg/kg）均能顯著降低血清中升高的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、層粘連蛋

6、白(laminin,LN）以及Ⅲ型前膠原（procollagenⅢ，PCⅢ）水平，升高白蛋白（albumin，ALB）濃度，病理組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，ATG能明顯減輕肝臟纖維化程度，降低肝組織中Hyp含量。同時，ATG還能降低肝臟組織中活化肝星狀細胞的數(shù)量，同時降低cyclin D1、CDK2/4及細胞增殖標志物PCNA蛋白的表達水平，上調(diào)細胞周期阻抑物蛋白p27kip1的表達。通過觀察ATG對PDGF-BB誘導(dǎo)激活的HSCs抑制增殖作用及其

7、相關(guān)作用機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在無細胞毒作用濃度下，ATG可抑制PDGF激活的HSCs增殖和DNA合成，將HSCs的細胞周期阻止在G0/G1期，在G1期早期，ATG通過下調(diào)cyclinD1、CDK4/6表達水平，顯著抑制細胞周期素依賴性激酶CDK4/6的活性。同時，在G1/S轉(zhuǎn)換期，ATG還能顯著上調(diào)細胞周期抑制物蛋白p27kip1的表達和CDK2-p27kip1復(fù)合體的形成，從而抑制CDK2的活性，實現(xiàn)對HSCs G0/G1細胞周期的全面阻

8、滯作用。此外，通過p27kip1基因沉默方法，降低ATG誘導(dǎo)下的p27kip1基因表達水平，可以同時消除由ATG誘導(dǎo)的細胞周期阻滯和細胞增殖抑制作用，證實了ATG對HSCs周期阻滯和增殖抑制作用，主要通過上調(diào)p27kip1基因表達水平來實現(xiàn)。在PDGF-BB激活的HSCs中，ATG抑制了HSCs中Akt及下游轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a的磷酸化水平，同時降低FOXO3a與14-3-3蛋白的結(jié)合能力，誘導(dǎo)FOXO3a的核轉(zhuǎn)位能力；此外，通過RNA

9、干擾技術(shù)，特異性地沉默F(xiàn)OXO3a基因表達水平，可以明顯降低ATG介導(dǎo)的p27kip1蛋白表達水平。
　　結(jié)論：ATG對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝損傷和肝纖維化具有顯著的治療作用，其作用機制可能通過阻抑 PI3K/Akt蛋白激酶的磷酸化激活，阻斷其下游調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a的磷酸化，進而誘導(dǎo)FOXO3a發(fā)生核轉(zhuǎn)移，并上調(diào)p27kip1蛋白表達水平，從而實現(xiàn)對CDK2激酶活性的抑制，使HSCs無法完成從G1期向S期的轉(zhuǎn)變，發(fā)揮抑制活化