Hint1抑制肝纖維化作用機制的研究.pdf

1、研究背景:TGF-β信號通路在肝纖維化的進程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,同時大量研究表明Wnt/β-catenin信號通路的異常激活與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Hint1,三聯(lián)組氨酸核苷結(jié)合蛋白1,是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子,有研究表明Hint1能在轉(zhuǎn)錄水平抑制TGF-β和Wnt/β-catenin兩條信號通路。盡管如此,卻鮮有Hint1對肝纖維化影響的相關(guān)報道。因此,我們假設(shè)Hint1基因能通過同時抑制TGF-β和Wnt/β-catenin兩

2、條信號通路,來實現(xiàn)多靶點抗肝纖維化的目標(biāo),較以前的單一靶點抑制具有顯著優(yōu)勢。
　　目的:通過體外過表達Hint1基因觀察其對重組Wnt3a活化的HSC-T6細(xì)胞的影響,通過體內(nèi)過表達Hint1基因觀察其對實驗性大鼠肝纖維化的影響。
　　方法:本實驗采用慢病毒為載體,構(gòu)建攜帶Hint1基因全長的慢病毒質(zhì)粒pGC-FU-Hint1-EGFP-3FLAG,并包裝出Hint1重組慢病毒(Lentivirus-Hint1)及其對照空載

3、體慢病毒(Lentivirus-EGFP),將其感染HSC-T6細(xì)胞,觀察過表達Hint1基因?qū)χ亟MWnt3a活化的HSC-T6細(xì)胞的影響,Western-blot檢測α-SMA、COLIA1、TGF-β1、Smad3、Smad7、β-catenin和CyclinD1蛋白表達的變化,Real-TimePCR檢測MMP-2、TIMP-1基因表達的變化。同時將Hint1重組慢病毒通過尾靜脈注射的方式導(dǎo)入大鼠體內(nèi),四氯化碳法建立肝纖維化模型,

4、造模8周后HE及Masson染色觀察肝組織的病理改變,測定羥脯氨酸評估肝組織內(nèi)膠原含量的變化,免疫組化檢測α-SMA、TGF-β1、Vimentin表達的變化,Real-TimePCR檢測纖維化相關(guān)基因表達的變化。
　　結(jié)果:在體外實驗中,Hint1基因過表達可以抑制重組Wnt3a對HSC-T6細(xì)胞的活化,降低TGF-β1、Smad3、β-catenin和CyclinD1蛋白的表達,相反卻可以增加Smad7蛋白的表達,同時還通過上

5、調(diào)MMP-2基因的表達,下調(diào)TIMP-1基因的表達來促進細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在體內(nèi)實驗中,Hint1組較模型組肝纖維化程度明顯減輕,羥脯氨酸的含量顯著降低,α-SMA、TGF-β1、Vimentin蛋白的表達下降,肝纖維化相關(guān)基因TGF-β1、Smad3、β-catenin、CyclinD1的表達下調(diào),Smad7的表達上調(diào),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而空載體組和模型組各指標(biāo)之間無明顯