慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾抑制肝星狀細(xì)胞結(jié)締組織生長因子表達(dá)及其抗肝纖維化作用.pdf

1、病毒、酒精、肝毒性藥物等因素所致的慢性肝損害，均會產(chǎn)生肝纖維化，進(jìn)而發(fā)展為肝硬化，目前尚無有效的根治辦法。我國罹患慢性肝損害的人數(shù)眾多，尋找有效的抗肝纖維化方法，阻止肝硬化的進(jìn)展，是亟待解決的問題。
　　結(jié)締組織生長因子（CTGF）作為促肝纖維化的主要細(xì)胞因子，在肝纖維化的機(jī)制中發(fā)揮重要作用。CTGF主要通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子－β（TGF-β）活化肝星狀細(xì)胞（HSC），導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過度積聚，從而導(dǎo)致肝纖維化。HSC活化是

2、肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，CTGF在HSC中的高表達(dá)是HSC活化不可或缺的條件，因此，抑制CTGF在HSC中的表達(dá)，就有可能阻止HSC的激活，進(jìn)而阻止肝纖維化的進(jìn)程。
　　RNA干擾（RNA interference，RNAi）是生物體內(nèi)一種序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS），慢病毒載體是常用的介導(dǎo)RNAi的病毒載體之一，既可感染分裂期細(xì)胞又可以感染非分裂期細(xì)胞，不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，能高效地感染靶細(xì)胞，表達(dá)的持續(xù)時間較長，

3、是基因沉默的有效工具。
　　本研究選擇HSC為靶細(xì)胞，以CTGF為切入點(diǎn)，應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)，沉默CTGF基因功能，探討其在HSC活化中的作用，為肝纖維化的防治及其發(fā)病機(jī)制研究提供有益的支持。
　　1、包含目的基因的RNAi慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
　　根據(jù)GenBank收錄的大鼠CTGF(NM_022266)基因序列設(shè)計了4條siRNA及1條陰性對照序列，退火形成雙鏈DNA，雙酶切后定向克隆到慢病

4、毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pGCL-GFP中，克隆轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，PCR鑒定及DNA序列測定證實所插入的片段序列與合成序列完全一致，表明已成功構(gòu)建了5個包含目的基因（1個為陰性對照基因）的慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。
　　2、RNAi慢病毒載體的包裝及篩選
　　將構(gòu)建成功的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與兩種輔助包裝元件載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝成4個表達(dá)CTGFsiRNA及1個陰性對照siRNA的慢病毒載體。繼而將5個重組體分別感染HSC-T6，應(yīng)用RT-P

5、CR和WesternBlot篩選出1個抑制效率最高的重組體，命名為Len／siRNA-CTGF，作為隨后實驗應(yīng)用的工具載體，其瞬時感染的抑制效率達(dá)84.6％。
　　3、慢病毒載體介導(dǎo)的CTGF基因沉默效應(yīng)及其對下游基因表達(dá)的影響
　　HSC-T6作為活化的肝星狀細(xì)胞系，以高水平表達(dá)I型膠原（COLI）、金屬蛋白酶組織抑制因子－1(TIMP-1)和TIMP-2為特點(diǎn)。通過了解HSC-T6在CTGF基因沉默前后COLI、TIMP

6、-1和TIMP-2的mRNA的變化，來分析CTGF對HSC活化的影響。
　　將Len／siRNA-CTGF及陰性對照病毒分別感染HSC－T6細(xì)胞，96h后采用RT-PCR的方法驗證Len／siRNA-CTGF對HSC-T6中CTGF的抑制效果，并檢測Len／siRNA-CTGF對TIMP-1、TIMP-2及COLI等表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Len／siRNA-CTGF可以顯著抑制肝星狀細(xì)胞系HSC-T6細(xì)胞中CTGF基因的表達(dá)，抑制效

7、率達(dá)到70％左右；且CTGF被抑制的同時，TIMP-1、TIMP-2及COLI的表達(dá)量分別下降到陰性對照組的23％、18％和50％。
　　4、CTGF基因沉默與HSC增殖、活化的關(guān)系
　　碘化丙啶（PI）染色流式細(xì)胞儀DNA含量分析法（PI/FCM）分析HSC-T6DNA含量、MTT法觀察細(xì)胞生長曲線，發(fā)現(xiàn)在CTGF基因沉默后HSC-T6的增殖及生長均受到抑制。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建并篩選出了介導(dǎo)CTGF基因