安吉白茶高氨基酸相關(guān)基因分離及鑒定.pdf

1、安吉白茶是在浙江省安吉縣海拔800米的高山上發(fā)現(xiàn)的自然突變體茶樹，其葉片具有階段性返白現(xiàn)象。對安吉白茶葉片氨基酸組分及含量進行分析，發(fā)現(xiàn)安吉白茶葉片在階段性返白過程中，氨基酸含量差異顯著，白期總氨基酸含量比綠期高2～3倍。該研究利用安吉白茶為材料，通過對其返白前后差異表達基因的克隆分析，試圖探明安吉白茶在白化期氨基酸含量呈現(xiàn)明顯提高的分子機理。其主要研究結(jié)果如下： 建立了從富含多酚與多糖的茶樹葉片中制備高質(zhì)量總RNA的方法，即

2、在傳統(tǒng)Tri-Reagent法的基礎(chǔ)上進行改良，在沉淀RNA時先加入1/2倍體積的高鹽，再加入1/2倍體積的異丙醇，以除去茶多糖的干擾；同時使整個操作過程在低溫環(huán)境下迅速連貫的進行，以防止褐化效應并減少RNA酶的污染。利用改良的方法所提取的茶樹總RNA，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定，可見2條清晰的28sRNA和18sRNA譜帶，且前者明顯強于后者，表明RNA完整性好，無明顯降解現(xiàn)象。 應用抑制消減雜交技術(shù)(Suppression subt

3、ractive hybridization，SSH)分離安吉白茶白期葉與綠期葉差異表達基因，成功構(gòu)建了安吉白茶白期葉與綠期葉的正、反向消減文庫。從正反向消減文庫中隨機挑選160個陽性克隆，通過菌落PCR和斑點雜交技術(shù)進行鑒定，共獲得80個差異表達明顯的cDNA片段，其大小在200bp～800bp之間。 將80個陽性克隆測序，測序結(jié)果與Gen Bank數(shù)據(jù)庫進行比對分析，其結(jié)果表明這些基因片段與光呼吸、能量代謝、蛋白質(zhì)代謝、脅迫

4、反應、糖代謝等多個代謝途徑相關(guān)。其中，1-5基因推測編碼的氨基酸序列與擬南芥絲氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶的氨基酸序列有83％的相似性。1-9基因推測編碼的氨基酸序列與擬南芥絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列有90％的相似性。2-13基因推測編碼的氨基酸序列與鈣調(diào)熱激蛋白具有94％的相似性。 采用熒光定量PCR技術(shù)對該3個基因在安吉白茶白期與綠期葉片中的表達水平進行分析的結(jié)果表明，1-5基因和1-9基因在白期葉片中表達水平較綠期高，2-13

5、基因在綠期葉片中表達水平較白期高。 根據(jù)本論文的研究結(jié)果，可以初步推測安吉白茶階段性返白是受鈣調(diào)熱激蛋白的調(diào)控，其茶氨酸與其它氨基酸在白期超常富集的原因可能是絲氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶和絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶過表達的結(jié)果。每年春茶早期，當環(huán)境溫度較低時，鈣調(diào)熱激蛋白基因被抑制表達，而絲氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶和絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因得以超表達，從而促進了氨基酸及茶氨酸的生物合成，表現(xiàn)出白期葉片中氨基酸與茶氨酸的水平較高；而在春茶中、后期，隨著