自噬在人肺腺癌細(xì)胞放療抵抗形成中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：在中國(guó)，近年來肺癌的發(fā)病率和死亡率均高居惡性腫瘤首位。全球及美國(guó)癌癥最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，癌癥新發(fā)病例數(shù)明顯增加，其中肺癌新發(fā)病例數(shù)及死亡率攀升，在男性中均為首位。肺癌根據(jù)病理類型分為小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85％，而肺腺癌(lung adenocarcinom

2、a，LAD)是非小細(xì)胞肺癌最常見的組織學(xué)類型之一。肺腺癌的主要治療手段包括手術(shù)、化療、放療、分子靶向治療等。近十年來，隨著大型精確放療設(shè)備的不斷研制開發(fā)，計(jì)算機(jī)技術(shù)和醫(yī)學(xué)影像學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，放射治療的技術(shù)水平不斷提高，副反應(yīng)和并發(fā)癥明顯減少，放射治療已經(jīng)成為治療腫瘤的主要而有效的手段之一。肺癌起病隱匿，多數(shù)患者就診時(shí)已為局部晚期或出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，往往失去根治性手術(shù)機(jī)會(huì)。術(shù)后輔助放療及放化療同步已成為臨床中常用的綜合治療策略。臨床中，放療后局

3、部復(fù)發(fā)或未控的患者十分常見，因此，放療抵抗成為降低放射治療臨床療效、影響患者預(yù)后的主要障礙之一。腫瘤放療抵抗的機(jī)制比較多見的有:腫瘤干細(xì)胞存在、DNA損傷修復(fù)增強(qiáng)、腫瘤乏氧狀態(tài)、P53突變、自噬增強(qiáng)、MicroRNAs調(diào)節(jié)異常、各種生長(zhǎng)因子過表達(dá)等。自噬是衰老的細(xì)胞器或者大分子物質(zhì)在溶酶體中降解為氨基酸、脂肪酸以及核苷酸進(jìn)行重復(fù)利用的程序性死亡過程，它在維持細(xì)胞自身動(dòng)態(tài)平衡和基因組完整性中起重要作用。我們實(shí)驗(yàn)室前期用逐漸增加多西他賽濃度

4、的方法在體外誘導(dǎo)人肺腺癌SPC-A1細(xì)胞，自建了SPC-A1耐多西他賽細(xì)胞株SPC-A1/DTX。并且，實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)證實(shí)，高水平的自噬可促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞對(duì)多西他賽耐藥的產(chǎn)生。而自噬怎樣參與到肺腺癌細(xì)胞放療抵抗形成的過程及機(jī)制，國(guó)內(nèi)外研究尚不充分。本研究旨在通過研究自噬對(duì)耐藥細(xì)胞放療抵抗產(chǎn)生的原因及其可能的機(jī)制，并探討了調(diào)節(jié)自噬水平對(duì)人肺腺癌細(xì)胞放療敏感性的影響。
　　材料與方法：
　　1、采用透射電鏡觀察人肺腺癌親本細(xì)

5、胞SPC-A1和耐藥細(xì)胞SPC-A1/DTX自噬小體形成情況，兩株細(xì)胞各分為兩組:未經(jīng)放射線照射組及6Gy劑量照射組。處理后的細(xì)胞分別在透射電鏡下觀察自噬體形成情況。
　　2、熒光顯微鏡檢測(cè)親本人肺腺癌細(xì)胞SPC-A1和耐藥細(xì)胞SPC-A1/DTX放療前后的GFP-LC3熒光密度變化，以及給予藥物(3-MA)及下調(diào)Survivin表達(dá)降低自噬水平后，耐藥株細(xì)胞GFP-LC3熒光密度變化。親本細(xì)胞與耐藥細(xì)胞比較時(shí)，兩株細(xì)胞各分為兩組

6、:未經(jīng)放射線照射組及6Gy劑量照射組;抑制自噬水平時(shí)，耐藥細(xì)胞分為4組:空白對(duì)照組，3-MA/siRNA-Survivin組，6Gy/6Gy+siRNA-control照射組，3-MA/siRNA-Survivin+6Gy照射組。
　　3、Western Blot技術(shù)測(cè)定自噬相關(guān)蛋白標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ/Ⅰ、p62、beclin-1、Survivin蛋白表達(dá)變化。親本細(xì)胞與耐藥細(xì)胞比較時(shí)，兩株細(xì)胞各分為兩組:未經(jīng)放射線照射組及6Gy劑量

7、照射組。在SPC-A1/DTX細(xì)胞中，應(yīng)用自噬抑制劑3-MA預(yù)處理或使用Survivin siRNA下調(diào)Survivin表達(dá)，樣品蛋白分為4組處理組:空白對(duì)照組，3-MA/siRNA-Survivin組，6Gy/6Gy+siRNA-control照射組，3-MA/siRNA-Survivin+6Gy照射組。
　　4、流式細(xì)胞學(xué)分析凋亡和細(xì)胞周期分布變化。
　　5、MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞生存能力和增殖能力改變情況。<

8、br>　　結(jié)果：
　　1、化療耐藥的人肺腺癌耐多西他賽細(xì)胞SPC-A1/DTX比親本細(xì)胞SPC-A1更耐受放療，接受相同放療劑量后增殖能力更強(qiáng)，ED50值較高（耐藥株均值約為7.5Gy，親本株均值約為4Gy）(P＜0.05)。
　　2、SPC-A1/DTX比SPC-A1自噬小體明顯增多、帶GFP標(biāo)簽的LC3熒光密度增強(qiáng)，自噬相關(guān)蛋白標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ/Ⅰ、p62、beclin-1表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05)，提示自噬水平較高。

9、>　　3、放射線同時(shí)可引起兩種細(xì)胞株自噬水平的增高。給予藥物(自噬抑制劑3-MA)預(yù)先處理耐藥細(xì)胞，或者使用Survivin siRNA下調(diào)Survivin表達(dá)后給予放療，可顯著抑制自噬標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ/Ⅰ和beclin-1、上調(diào)p62表達(dá)(P＜0.05)，使GFP-LC3熒光密度明顯降低，提示可降低耐藥細(xì)胞的自噬水平。
　　4、給予藥物（自噬抑制劑3-MA）預(yù)先處理耐藥細(xì)胞，或者使用Survivin siRNA下調(diào)Survivin