Rapamycin聯(lián)合SAHA對人肺腺癌細胞的放療增敏效應及機制.pdf

1、目的：
　　觀察雷帕霉素（Rapamycin）聯(lián)合組蛋白去乙?；敢种苿╤istonedeacetylaseinhibitor，HDACi）辛二酰苯胺異羥肟酸（suberoylanilidehydroxamicacid，SAHA）對人肺腺癌A549細胞放療敏感性的影響并探討可能的分子機制。
　　方法：
　　1.Rapamycin、SAHA聯(lián)合用藥劑量確定：體外培養(yǎng)A549細胞，給予不同濃度Rapamycin（0nmo

2、l/L、0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L）、SAHA（0μmol/L、1μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）以及兩藥交叉聯(lián)合處理24h，MTT法檢測細胞增殖抑制率，計算兩藥聯(lián)合作用A549細胞24h后10％細胞生長抑制的濃度（IC10）。
　　2.觀察Rapamycin聯(lián)合SAHA對A549細胞放療敏感性影響：A549細胞給予IC10處理

3、24h，后給予4GyX線照射，采用細胞克隆形成實驗檢測A549細胞增殖活性。
　　3.Rapamycin聯(lián)合SAHA放療增敏機制研究
　?。?）檢測Rapamycin聯(lián)合SAHA對A549細胞放療后DSBs修復影響：A549細胞給予IC10處理24h，后給予4GyX線照射，采用Westernblot和免疫熒光檢測放療后1h和24hγ-H2AX蛋白表達變化和焦點形成；采用Westernblot檢測放療后4hRad51、Ku80

4、、Ku70蛋白表達變化；采用RT-qPCR檢測放療后4hRad51mRNA、Ku80mRNA、Ku70mRNA表達變化。
　?。?）檢測Rapamycin聯(lián)合SAHA對A549細胞自噬和乙?；绊懀篈549細胞給予Rapamycin或/和SAHA處理24h，以及4GyX線照射，采用透射電鏡檢測A549細胞自噬體形成情況；Westernblot檢測LC3、p62表達變化。A549細胞給予SAHA、Rapamycin+SAHA處理24

5、h，采用Westernblot檢測乙酰化組蛋白H3（Acetyl-HistoneH3，Ac-H3）表達變化。
　　結(jié)果：
　　1.Rapamycin、SAHA聯(lián)合用藥劑量確定：Rapamycin和SAHA對A549細胞生長均具有抑制作用，呈劑量依賴性；聯(lián)合用藥組對A549細胞的抑制率較單獨用藥組增高（p＜0.05）。兩藥聯(lián)合劑量濃度IC10=Rapamycin:100nmol/L；SAHA:2.5μmol/L。
　　2

6、.Rapamycin聯(lián)合SAHA影響A549細胞放療敏感性：細胞克隆形成實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CTL組、IR組、IR+R組、IR+S組、IR+R+S組細胞存活分數(shù)（survivalfraction，SF）分別為100.0±0.00%、67.8±6.32%、43.1±7.18%、58.5±1.17%、21.1±7.01%，相比IR組，IR+R+S組SF下降最明顯（p＜0.05）。
　　3.Rapamycin聯(lián)合SAHA影響A549細胞DSB

7、s修復過程：
　?。?）Westernblot和免疫熒光檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比CTL組，放療后1h各實驗組γ-H2AX蛋白和γ-H2AX焦點表達增加（p＜0.05），組間無差異（p＞0.05），24h后各實驗組γ-H2AX蛋白和γ-H2AX焦點表達均有所下降，IR+R+S組下降幅度最小（p＜0.05）。
　?。?）Westernblot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比CTL組，IR組Rad51蛋白表達增加（p＜0.05），Ku80、Ku70蛋

8、白表達無顯著差異（p＞0.05）。相比IR組，IR+R組、IR+R+S組Rad51蛋白表達下降（p＜0.05），IR+R組、IR+S組、IR+R+S組Ku80蛋白表達下降（p＜0.05），IR+R+S組Ku70蛋白表達下降（p＜0.05）；相比各實驗組IR+R+S組Rad51、Ku80、Ku70蛋白表達下降最大（p＜0.05）。
　?。?）RT-qPCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比CTL組，放療后4hIR組、IR+R組Rad51、Ku80、

9、Ku70mRNA表達均有所增加（p＜0.05），組間無差異（p＞0.05）。相比IR組，IR+S組、IR+R+S組Rad51、Ku80、Ku70mRNA表達均有不同程度下降（p＜0.05），組間無差異（p＞0.05）。
　　4.Rapamycin聯(lián)合SAHA影響A549細胞自噬和乙酰化水平：
　?。?）透射電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Rapamycin、放療均能使A549細胞自噬體形成增加，Rapamycin作用最為明顯。Westernb