自噬在輻射誘導肺上皮間質(zhì)轉化中的作用機制研究.pdf

1、目的：放療是臨床治療惡性腫瘤的常用方法，然而胸部照射誘發(fā)的放射性肺纖維化（radiation-induced pulmonary fibrosis,RPF），是放療最為棘手的并發(fā)癥。放射性肺纖維化病理上以成纖維細胞聚集，肺泡 II型上皮細胞損傷，細胞外基質(zhì)和膠原沉積為主要特征。我們的前期研究表明，輻射誘導肺泡上皮細胞（alveolar epithelial cells，AECs）發(fā)生上皮間質(zhì)轉化（epithelial-mesenchym

2、al transition，EMT）進而轉化成成纖維細胞是放射性肺纖維化的重要細胞來源。自噬（autophagy）是細胞在靜息和應激狀態(tài)下維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種高度保守的細胞行為。通過自噬體、溶酶體的相繼組裝形成自噬溶酶體，從而實現(xiàn)胞內(nèi)需降解的細胞器、蛋白質(zhì)等成分的降解反應。自噬的發(fā)生主要以自噬體膜結合型標志蛋白LC3I/II、Beclin-1的誘導表達、p62的降解等為典型特征。在實驗室以往的研究中，我們發(fā)現(xiàn)，EMT的重要分子信號通路蛋

3、白β-連環(huán)蛋白（β-catenin）在肺組織上皮細胞胞漿和胞核中表達增加，從而促進放射性肺纖維化中成纖維細胞增多，本研究從自噬在EMT引起放射性肺纖維化過程中的作用出發(fā)，探討自噬是否通過 Wnt/β-catenin通路來介導 EMT。因此我們希望系統(tǒng)研究自噬介導輻射誘導肺泡 EMT的作用機制，為探索放射性肺纖維化的發(fā)病機制及防止放射性肺纖維化的進一步發(fā)展提供新的線索。
　　方法：以人支氣管上皮細胞(Beas-2B)為靶細胞，給予6

4、 Gy60Coγ射線照射，利用免疫印跡技術在蛋白水平檢測 EMT、低氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）、自噬、Wnt/β-catenin信號通路的蛋白表達和活化情況，利用激光共聚焦技術檢測EMT表面蛋白的表達變化，利用流式分選技術分析EMT表面蛋白表型的改變。
　　結果：6Gy60Coγ射線照射Beas-2B細胞48h后發(fā)生明顯的EMT，建立輻射誘導的EMT模型。并且發(fā)現(xiàn)照射后

5、細胞內(nèi)HIF-1α蛋白被顯著的誘導表達，形成誘導低氧微環(huán)境；同時自噬標志性蛋白 LC3I/II，Bcelin-1表達增多，而p62表達下調(diào)，促使細胞自噬發(fā)生；60Coγ射線照射后引起β-catenin蛋白表達增加，當下調(diào)β-catenin表達水平后，EMT相關蛋白表達抑制，而自噬標志性蛋白的表達水平并未出現(xiàn)明顯改變；抑制自噬后，Wnt/β-catenin信號通路活化受到明顯抑制；與此同時EMT相關蛋白表達下調(diào)。
　　結論：60Co