姜黃素誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬的作用及機(jī)制研究.pdf

1、根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)報(bào)道，在全世界范圍內(nèi)，乳腺癌在婦女癌癥中所占的比例約為23％，成為導(dǎo)致女性死亡的首要原因之一。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，乳腺癌的治療取得了巨大成就，但是西醫(yī)對(duì)乳腺癌的治療如放療，化療，手術(shù)等，也引起了人體耐藥及化療藥物的毒性反應(yīng)，隨著對(duì)中藥研究的逐漸深入，傳統(tǒng)中藥在乳腺癌腫瘤治療中的作用日益凸顯。
　　姜黃素(Cu

2、rcumin)是從姜科植物姜黃(Curcuma longa L.)的根莖中提取出來的一種黃色的酚性色素，姜黃在全世界分布廣泛。研究表明，姜黃素結(jié)構(gòu)中含有酚羥基、甲氧基等活性基團(tuán)，并且具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抗炎、抗氧化、抗出血、抗病毒和降低血脂的作用?？鼓[瘤方面的研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以抑制人乳腺癌細(xì)胞的生長，其作用機(jī)制可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也可以通過抑制腫瘤血管的生成，但在腫瘤細(xì)胞自噬方面的研究還很少，陳健的研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以誘導(dǎo)人乳腺癌

3、細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡，但其具體的作用機(jī)制并未完全闡明。本研究利用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)和單丹磺酰戊二胺（dansylcadaverine，MDC）染色觀察姜黃素作用后人乳腺癌MCF-7細(xì)胞發(fā)生自噬的形態(tài)學(xué)現(xiàn)象，用western blot蛋白印記法測定自噬相關(guān)蛋白及通路表達(dá)的變化，解釋了MCF-7細(xì)胞在姜黃素作用下發(fā)生自噬的可能作用及作用機(jī)理，希望為抗乳腺癌新藥在臨床上

4、的研發(fā)提供理論依據(jù)。
　　本研究分為三個(gè)組別，分別包括溶劑對(duì)照組，空白對(duì)照組和姜黃素組（姜黃素濃度設(shè)置為10，20，40，80和160μmol·L-1），時(shí)間點(diǎn)設(shè)定為24，48和72h。采用四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測姜黃素對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率，TEM從細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)直觀的證實(shí)細(xì)胞的自噬現(xiàn)象，MDC染色觀察細(xì)胞中自噬泡的變化情況。Western blot方法測定:自噬相關(guān)蛋白

5、Beclin1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ(microtubule-associated protein1light chain3Ⅱ,LC3Ⅱ)，以及通路蛋白激酶B(protein kinase B，pkB，又稱Akt)，p-Akt的表達(dá);加入磷脂酰肌醇-3磷酸激酶(phosphatidylino sitol3-kinase，PI3K)/Akt通路抑制劑LY294002(LY)之后Beclin1，LC3Ⅱ，Akt和p-Akt的表達(dá);加入自噬

6、抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)和自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin，RAP)之后Beclin1和LC3Ⅱ的表達(dá)。
　　研究結(jié)果如下:
　　1.姜黃素對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖具有抑制作用
　　MTT法結(jié)果表明，不同濃度的姜黃素藥物組對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長均具有抑制作用。數(shù)據(jù)表明，不同濃度的姜黃素在同一時(shí)間對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制率與空白對(duì)照組相比均具有顯著性差異(P＜0.05)，并且

7、對(duì)細(xì)胞的抑制率隨著姜黃素藥物濃度的增加而增高;姜黃素對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率在不同的藥物濃度組之間相比也具有顯著性差異(P＜0.05)。相同濃度的姜黃素藥物組在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制率具有顯著性差異，并且隨著藥物處理時(shí)間的延長而升高。與空白對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)對(duì)MCF-7細(xì)胞的最大抑制率沒有超過1％，說明DMSO對(duì)細(xì)胞的增殖幾乎沒有影響(P＞0.05)，所以溶

8、劑對(duì)照組在后面的實(shí)驗(yàn)中不再設(shè)立。
　　2.姜黃素作用MCF-7細(xì)胞后自噬形態(tài)學(xué)觀察
　　2.1 TEM觀察細(xì)胞形態(tài)
　　TEM結(jié)果顯示，空白對(duì)照組MCF-7細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，而經(jīng)過姜黃素處理后，細(xì)胞內(nèi)可觀察到自噬現(xiàn)象的重要特征——自噬泡。
　　2.2 MDC染色結(jié)果
　　與空白對(duì)照組相比，姜黃素處理細(xì)胞后MDC染色產(chǎn)生的綠色熒光的強(qiáng)度隨著姜黃素濃度的增加逐漸加強(qiáng)，并且染色細(xì)胞的數(shù)量也隨之增多。上述結(jié)果說明，姜黃

9、素可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞內(nèi)自噬泡的形成。
　　3.姜黃素誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞自噬
　　從western blot結(jié)果可以分析出，姜黃素能夠降低MCF-7細(xì)胞中p-Akt的蛋白水平，從而上調(diào)MCF-7細(xì)胞中Beclin1和LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)。使用PI3K/Akt通路抑制劑LY之后，與LY處理組或姜黃素處理組相比，LY與姜黃素同時(shí)處理組可抑制p-Akt蛋白表達(dá)量，且存在顯著性(P＜0.01)差異;加入自噬抑制劑3-MA和自噬誘導(dǎo)劑R

10、AP，與姜黃素處理組相比，3-MA和姜黃素同時(shí)處理顯著(P＜0.05)地減弱姜黃素對(duì)二者蛋白表達(dá)量的促進(jìn)作用，RAP和姜黃素同時(shí)處理顯著(P＜0.01)地增強(qiáng)姜黃素對(duì)Beclin1和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量的促進(jìn)作用?？梢缘贸鼋S素可能是通過影響PI3K/Akt通路發(fā)揮作用的。
　　本研究的結(jié)果可以表明:
　　1.姜黃素能夠抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。
　　2.姜黃素可能是通過抑制p-Akt蛋白，上調(diào)Beclin