海馬神經(jīng)元表面受體識(shí)別的單分子力譜方法建立研究.pdf

1、海馬區(qū)是大腦的重要組成部分，參與調(diào)節(jié)了短期記憶、學(xué)習(xí)、認(rèn)知及情緒等多種生理功能。海馬神經(jīng)元是海馬區(qū)的主要成分，其表面分布著各種重要的功能性受體，當(dāng)這些受體與相應(yīng)配體作用后會(huì)傳導(dǎo)生物信號(hào)，從而影響學(xué)習(xí)、記憶等各種重要的神經(jīng)活動(dòng)。當(dāng)前，如何深入、完整理解受體和配體之間的識(shí)別作用及作用過(guò)程中的生物、物理機(jī)制已成為人們關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)。對(duì)這些問(wèn)題的深入認(rèn)識(shí)需要從單分子水平開(kāi)展研究工作。目前傳統(tǒng)的檢測(cè)方法只能對(duì)受體與配體的作用進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到受體

2、與配體相互作用的平均信息，難以在單分子層面對(duì)其進(jìn)行精確的認(rèn)識(shí)。基于原子力顯微鏡（AFM）的單分子力譜技術(shù)的出現(xiàn)彌補(bǔ)了這一空白。AFM單分子力譜技術(shù)已經(jīng)開(kāi)始被用于細(xì)胞表面受體識(shí)別作用的研究，但是將這種技術(shù)應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞表面受體識(shí)別研究還處在起步階段，需要對(duì)其進(jìn)一步發(fā)展。海馬神經(jīng)元表面分布了許多受體，比如酪氨酸激酶受體B（TrkB）， N-甲基-D-天冬氨酸-型谷氨酸（NMDA）受體和γ-氨基丁酸（GABA B）受體等，其中TrkB受體是海

3、馬神經(jīng)元表面的一種重要受體，該受體與腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）有高度的特異性。它們之間的相互作用對(duì)海馬神經(jīng)元的功能發(fā)揮具有非常重要的作用。本課題將以海馬神經(jīng)細(xì)胞表面的TrkB受體和BDNF分子為研究對(duì)象，以AFM力學(xué)檢測(cè)技術(shù)為研究手段，旨在建立一種可用于該體系檢測(cè)的單分子力譜技術(shù)。
　　本研究建立了海馬神經(jīng)元培養(yǎng)體系。我們選用剛出生的乳鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，解剖分離

4、出乳鼠的海馬組織，經(jīng)過(guò)消化和培養(yǎng)后，成功得到了海馬神經(jīng)元的原代細(xì)胞。然后利用AFM高分辨率成像技術(shù)，對(duì)培養(yǎng)成熟的神經(jīng)元進(jìn)行了AFM成像，獲得了海馬神經(jīng)元的細(xì)胞形貌信息。采用化學(xué)修飾方法將α，ω-二羧基聚乙二醇（ HOOC-PEG3500-COOH）分子的一端通過(guò)羧基連接到AFM探針上，再將另一端羧基與無(wú)機(jī)金基底的氨基作用進(jìn)行單分子力譜檢測(cè)。對(duì)單分子力譜數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合和統(tǒng)計(jì)分析后，我們得到α，ω-二羧基聚乙二醇分子脫離基底的作用力大小為10

5、2.90±7.03 pN；α，ω-二羧基聚乙二醇分子長(zhǎng)度為17.96±0.93 nm[自由連接鏈模型（Freely jointed chain，F(xiàn)JC）擬合]和19.40±1.68 nm[蠕蟲(chóng)鏈模型（Worm-like chain，WLC）擬合]。所測(cè)到的α，ω-二羧基聚乙二醇與金基底作用力大小以及其長(zhǎng)度均與對(duì)應(yīng)的理論值相吻合。上述實(shí)驗(yàn)證明，我們成功地將α，ω-二羧基聚乙二醇分子連接在了AFM探針上，為進(jìn)一步將BDNF蛋白連接在AFM探

6、針上奠定了基礎(chǔ)。研究了海馬神經(jīng)細(xì)胞膜表面TrkB受體與BDNF蛋白識(shí)別的單分子力譜。先將BDNF蛋白通過(guò)α，ω-二羧基聚乙二醇分子的另一個(gè)末端連接到AFM探針，再通過(guò)AFM力學(xué)測(cè)量技術(shù)將修飾蛋白的探針與海馬神經(jīng)元表面 TrkB受體作用，開(kāi)展單分子力譜識(shí)別實(shí)驗(yàn)。對(duì)單分子力譜數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合和統(tǒng)計(jì)分析后，我們得到BDNF蛋白與TrkB受體作用解離作用力大小為206.81±8.13 pN，該數(shù)值處于受體與配體作用力范圍之內(nèi)；α，ω-二羧基聚乙二醇

7、與BDNF蛋白連接復(fù)合物的長(zhǎng)度為25.34±1.21 nm（FJC模型）和26.56±1.52 nm（WLC模型），這些實(shí)驗(yàn)得到的長(zhǎng)度數(shù)值與α，ω-二羧基聚乙二醇與BDNF蛋白連接形成的復(fù)合物的的理論值相吻合。上述實(shí)驗(yàn)證明，我們將BDNF蛋白連接到了AFM探針上，成功地利用BDNF對(duì)海馬神經(jīng)元表面TrkB受體在單分子水平進(jìn)行了識(shí)別。發(fā)展了海馬神經(jīng)元培養(yǎng)體系，BDNF蛋白通過(guò)α，ω-二羧基聚乙二醇修飾到了AFM探針，研究了海馬神經(jīng)細(xì)胞膜表