nNOS調控成年海馬齒狀回神經元再生及其分子機制研究.pdf

1、近年來神經科學研究的一項重要進展是發(fā)現(xiàn)成年哺乳動物腦內某些特定區(qū)域在正常狀態(tài)下存在著進行性的神經元再生。在某些生理刺激和病理狀態(tài)下，這些部位的神經發(fā)生表現(xiàn)出明顯的增強現(xiàn)象。這意味著通過調控某些缺血相關的分子可激活內源性神經元再生機制，促進腦損傷修復。顯然，闡明腦缺血激發(fā)神經元再生的分子調控機制，將更新中風及其它神經退化性疾病的治療策略、明晰正確的藥物干預環(huán)節(jié)和發(fā)現(xiàn)新藥靶。然而，目前關于成年腦神經元再生的研究主要重于發(fā)現(xiàn)現(xiàn)象，而決定這些現(xiàn)

2、象的本質問題所知甚少。 NO作為中樞神經系統(tǒng)內的一種新型信號分子在成年腦神經元再生過程中發(fā)揮著重要作用，NO以及合成NO的NOS對神經元再生調控的研究目前已成為熱點問題。然而目前關于NO/NOS對神經元再生的調控的研究卻一直存在著矛盾的結果。新近有報道指出，nNOS源性的NO在生理狀態(tài)下抑制了成年動物SVZ區(qū)的神經元再生。然而，其對海馬DG區(qū)神經元再生目前為止還存在著爭議。此外，我們早期的研究結果表明，局灶性腦缺血后iNOS表達

3、增加激發(fā)了海馬DG區(qū)神經元再生。既然nNOS和iNOS的催化產物都是NO，那么nNOS在腦缺血后的表達有何變化，其對缺血后DG神經元再生有無影響，這些問題目前尚無明確報導，有待進一步確證。 因此，本論文旨在探討nNOS在生理狀態(tài)下以及腦缺血后對成年海馬DG區(qū)神經元再生的調控作用，并初步探討其對神經元再生的分子調控機制。闡明這一問題，將從一個側面揭示腦缺血激發(fā)神經元再生的細胞和分子調控機制，從而為腦缺血疾病的治療開辟新的路徑。

4、 第一章：生理狀態(tài)下nNOS抑制成年海馬齒狀回神經元再生 目的：通過藥理學方法抑制nNOS活性，觀察生理狀態(tài)下nNOS活性被抑制后對成年海馬齒狀回(dentategyrus，DG)神經元再生的影響。并對生理狀態(tài)下nNOS調控神經元再生的分子機制作初步探討。方法：采用選擇性nNOS抑制劑7-硝基吲唑(7-nitroindazole，7-NI)(30mg/kg，腹腔注射，連續(xù)給藥4次，給藥間隔為24小時)抑制nNOS活性，然后用

5、BrdU(50mg/kg，連續(xù)給藥6次，給藥間隔為12小時)標記新生細胞，觀察生理狀態(tài)下抑制nNOS對海馬DG區(qū)細胞的增殖和存活的影響；同時我們用BrdU/NeuN對新生細胞進行雙標記，以鑒定新生細胞的表型。為進一步探討nNOS調控神經元再生的分子機制，我們用分別給小鼠腹腔注射7-NI(30mg/kg，腹腔注射，連續(xù)給藥4次，給藥間隔為24小時)，MK-801(1mg/kg，腹腔注射，連續(xù)給藥4次，給藥間隔為24小時)以及7-NI+MK

6、-801(MK-801在7-NI之前15min給藥)(給藥劑量和方式同上)后，BrdU標記新生細胞，觀察各組海馬DG新生細胞的增殖，同時采用免疫熒光及Westernblot方法檢測海馬DG區(qū)p-CREB/CREB的表達。結果：7-NI抑制nNOS活性后，顯著促進了海馬DG區(qū)細胞的增殖和存活，BrdU/NeuN雙標記結果表明，在給予BrdU4周后，海馬顆粒細胞層有65﹪的BrdU陽性細胞同時被NeuN標記，7-NI組小鼠海馬DG區(qū)BrdU

7、+/NeuN+陽性細胞數(shù)目明顯高于其溶劑對照組。且給予7-NI后，海馬DG的CREB磷酸化水平較其溶劑對照組有顯著增高，而在給予7-NI之前給予NMDA受體拮抗劑MK-801則能夠顯著抑制7-NI誘導的海馬DG區(qū)神經元再生以及CREB磷酸化水平。結論：nNOS通過下調CREB磷酸化水平抑制了海馬DG區(qū)神經元再生，而NMDA受體的正常功能對于維持DG區(qū)神經元再生是不可缺少的。 第二章：腦缺血抑制nNOS表達激發(fā)成年海馬齒狀回神經元

8、再生 目的：大腦中動脈阻塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)法制備局灶性腦缺血再灌注模型，觀察局灶性腦缺血再灌注后對大鼠海馬DG區(qū)神經元再生以及nNOS表達的影響，并進一步探討局灶性腦缺血后nNOS調控海馬DG區(qū)神經元再生的分子機制。方法：采用頸內動脈線栓法阻塞大腦中動脈1.5hr，然后再灌注制備局灶性腦缺血模型。RT-PCR方法和Westernblot方法檢測局灶性腦缺血后nNOS的mRN

9、A水平和蛋白表達水平。為進一步探討缺血后nNOS的表達與海馬DG區(qū)神經元再生的關系以及缺血后nNOS對神經元再生的調控機制，我們采用選擇性nNOS抑制劑7-硝基吲唑(7-nitroindazole，7-NI)(30mg/kg,連續(xù)給藥5次，給藥間隔為24hr)抑制成年大鼠nNOS活性，BrdU(50mg/kg,連續(xù)給藥3次，給藥間隔為12hr)標記新生細胞，觀察其對海馬DG區(qū)神經元再生的影響，同時采用Westernblot方法檢測7-N

10、I在缺血后抑制nNOS活性對海馬DG區(qū)p-CREB/CREB的蛋白以及iNOS蛋白表達的影響。結果：局灶性腦缺血后，nNOS的mRNA水平和蛋白表達水平顯著下降，7-NI抑制nNOS活性都能夠顯著促進缺血后海馬DG區(qū)的神經元再生。缺血后，抑制nNOS活性上調了iNOS以及p-CREB的表達水平。結論：局灶性腦缺血后抑制nNOS表達促進了腦缺血海馬DG區(qū)神經元再生，且缺血后抑制nNOS增強海馬DG神經元再生是通過上調p-CREB和iNOS

11、表達水平而實現(xiàn)的。 第三章：nNOS通過影響端粒酶表達調控成年海馬齒狀回神經元再生 目的：探討生理狀態(tài)下以及腦缺血再灌注后，端粒酶在成年海馬DG區(qū)的表達及其對成年海馬DG神經元再生的影響，并初步觀察端粒酶對體外培養(yǎng)的神經干細胞的增殖的影響。此外，進一步探討nNOS對端粒酶表達的調控，從而證明nNOS是否通過影響端粒酶的表達而調控成年海馬齒狀回神經元再生。方法：采用頸內動脈線栓法阻塞大腦中動脈1.5hr，然后再灌注制備局灶

12、性腦缺血模型。TRAP法檢測生理狀態(tài)下以及局灶性腦缺血后海馬DG區(qū)端粒酶的活性。為進一步探討端粒酶的表達對海馬DG區(qū)神經元再生的影響以及nNOS是否通過影響端粒酶的表達調控成年海馬DG神經元再生，我們分別在生理狀態(tài)下給小鼠腹腔注射7-NI(30mg/kg，腹腔注射，連續(xù)給藥5次，給藥間隔為24小時)，端粒酶抑制劑脫氧疊氮胸苷(3'-azido-2',3'-dideoxythymidine，AZT)(100mg/kg，連續(xù)給藥5次，給藥間

13、隔為24小時)以及AZT+7-NI(AZT在7-NI之前15min給藥)(給藥劑量和方式同上)后，BrdU標記新生細胞，觀察各組動物海馬DG新生細胞的增殖，同時采用TRAP方法檢測海馬DG區(qū)端粒酶的表達。此外，我們在孕12-15天大鼠取胚胎鼠神經干細胞體外培養(yǎng)，觀察AZT(0.5mmol/L)對體外培養(yǎng)的神經干細胞增殖的影響。為探討缺血后端粒酶對海馬DG區(qū)神經元再生的影響，我們在缺血再灌后給缺血小鼠腹腔注射AZT(100mg/kg，連續(xù)

14、給藥5次，給藥間隔為24hr)。AZT末次給藥后，即刻給予動物BrdU(腹腔注射，50mg/kg，連續(xù)給藥4次，給藥間隔為12小時)標記新生細胞。為了研究腦缺血后，iNOS、nNOS是否通過調節(jié)端粒酶的表達而調控神經元再生，我們在缺血再灌后即刻給缺血小鼠腹腔注射氨基胍(aminoguanadine，AG)(100mg/kg，連續(xù)給藥5次，給藥間隔為24小時)和7-NI(30mg/kg，連續(xù)給藥5次，給藥間隔24h)，末此給藥6hr后，處

15、死動物，提取兩側海馬的端粒酶進行端粒酶活性分析。結果：生理狀態(tài)下AZT顯著抑制了成年小鼠海馬DG區(qū)神經元再生,并削弱了7-NI誘導的海馬DG區(qū)神經元再生增加。在生理狀態(tài)下，我們在對照組以及7-NI組均未檢測到DG區(qū)端粒酶的表達，然而，在腦缺血后第4d，端粒酶的活性顯著升高，且缺血后抑制端粒酶活性顯著削弱了腦缺血誘導的海馬DG區(qū)新生細胞的增殖。我們在體外培養(yǎng)的大鼠胚胎鼠神經干細胞中加入(0.5mmol/L)AZT，發(fā)現(xiàn)AZT顯著抑制了大鼠