Sox9通過(guò)AKT通路影響肝細(xì)胞癌對(duì)索拉菲尼耐藥性的研究.pdf

1、研究目的及背景:
　　肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是肝癌中的一種類(lèi)型，是常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]，其生物學(xué)行為較為惡性，但由于肝臟較強(qiáng)的代償能力，在疾病早期并沒(méi)有顯著的癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)腫瘤常常已經(jīng)處于進(jìn)展期，由于根治性手術(shù)治療，包括肝移植和肝腫瘤切除術(shù)或射頻消融只適用于部分早期患者[2]，中晚期患者缺乏有效的治療手段，故HCC的死亡率居各類(lèi)腫瘤死亡率的前列。在我國(guó)，肝細(xì)胞癌多繼發(fā)于乙型肝炎病毒感染，

2、丙型肝炎所致的肝細(xì)胞癌近年來(lái)比例有所增加。據(jù)報(bào)道[3]，對(duì)于患有病毒性肝炎的病人，其HCC的發(fā)病率是正常人群的20倍。失去手術(shù)機(jī)會(huì)的肝癌病人缺乏有效的治療手段，化療藥物對(duì)于進(jìn)展期HCC的作用并不十分理想。索拉菲尼是一類(lèi)新型靶向治療HCC的藥物[4]，其通過(guò)抑制RAF-1、B-RAF的絲/蘇氨酸激酶活性直接抑制腫瘤生長(zhǎng)，并且通過(guò)FLT-3、VGFR-2、VEGF-3、PDGF-β、KIT等多種受體的酪氨酸激酶活性來(lái)抑制腫瘤內(nèi)血管生長(zhǎng)從而間

3、接達(dá)到抑制腫瘤的目的[9]。但無(wú)論是索拉菲尼或化療藥物，HCC的耐藥性一直是阻礙其療效的重要因素，許多文獻(xiàn)報(bào)道HCC對(duì)于藥物的耐藥性與腫瘤干細(xì)胞息息相關(guān)。例如EpCAM陽(yáng)性的腫瘤于細(xì)胞可以介導(dǎo)HCC對(duì)于索拉菲尼的耐藥，Oct4陽(yáng)性的HCC細(xì)胞可以產(chǎn)生對(duì)多柔比星的耐藥[5、6]。
　　在HCC中腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志有許多，包括EpCAM，CD90，CD133，Oct4，Nancg等，Sox9近年來(lái)亦被認(rèn)為是HCC中腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志之一，

4、Sox9基因最初被發(fā)現(xiàn)參與性別形成步驟、軀干的發(fā)育及器官的成熟[7]，并且最近亦被發(fā)現(xiàn)其表達(dá)在多種腫瘤中升高。Sox9表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞顯示出腫瘤干細(xì)胞的特性，其促進(jìn)腫瘤的增殖，并且增強(qiáng)細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并可促進(jìn)肝癌干細(xì)胞自我更新[12]。此外Sox9通過(guò)Wnt、Notch、TGF-β通路影響腫瘤的發(fā)生及分化[13]，通過(guò)Notch通路及Numb蛋白促進(jìn)肝癌干細(xì)胞自我更新及增殖[8]。研究發(fā)現(xiàn)，癌組織高表達(dá)Sox9的肝癌患

5、者預(yù)后更差[11]。
　　故在此，我們希望探索Sox9是否參與HCC對(duì)索拉菲尼耐藥的過(guò)程，并且探索Sox9調(diào)控HCC對(duì)索拉菲尼耐藥的具體生物學(xué)機(jī)制，從而為解決HCC對(duì)索拉菲尼耐藥提供潛在的方法，豐富進(jìn)展期HCC治療的手段，從而改善一部分臨床患者的預(yù)后。研究方法與結(jié)果
　　第一部分探討肝細(xì)胞癌細(xì)胞在使用索拉菲尼后SOX9的表達(dá)情況。
　　在這一個(gè)部分里，我們使用SMMC-7721及LM3的肝癌細(xì)胞系進(jìn)行體外培養(yǎng)，并使用濃

6、度為4μM的索拉菲尼對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，并于0小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)，36小時(shí)，48小時(shí)，60小時(shí)以及72小時(shí)提取細(xì)胞RNA及蛋白，并設(shè)計(jì)Sox9特異性qPCR引物進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，使用Sox9特異性抗體通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行蛋白含量的檢測(cè)。此外使用多聚甲醛固定使用4μM索拉菲尼培養(yǎng)0小時(shí)，24小時(shí)，48小時(shí)的細(xì)胞，進(jìn)行免疫熒光及流式細(xì)胞儀的檢測(cè)。結(jié)果:1、在使用4μM的索拉菲尼進(jìn)行培養(yǎng)后，兩種肝癌細(xì)胞系的Sox9表達(dá)無(wú)論在轉(zhuǎn)錄水平或是蛋

7、白水平均呈上升趨勢(shì);2、免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在隨著使用索拉菲尼培養(yǎng)時(shí)間的增加，Sox9在核內(nèi)的表達(dá)上升。3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，細(xì)胞中Sox9陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量顯著增加。
　　第二部分研究Sox9表達(dá)及干擾對(duì)于肝細(xì)胞癌對(duì)索拉菲尼耐藥的影響
　　我們首先構(gòu)建了Sox9過(guò)表達(dá)及干擾的肝癌細(xì)胞系，使用定量PCR及免疫印跡驗(yàn)證后，使用濃度為4μM的索拉菲尼進(jìn)行體外培養(yǎng)，于1、3、5、7天使用CCK-8試劑進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)。此

8、外，取培養(yǎng)48小時(shí)后的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察腫瘤細(xì)胞的克隆形成能力，同時(shí)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡狀況檢測(cè)。結(jié)果:1、在使用含有索拉菲尼的培養(yǎng)液培養(yǎng)后，過(guò)表達(dá)Sox9的肝癌細(xì)胞活力高于對(duì)照組，而干擾Sox9表達(dá)的肝癌細(xì)胞活力低于對(duì)照組。2、過(guò)表達(dá)Sox9的肝癌細(xì)胞在使用4μM索拉菲尼培養(yǎng)48h后，其克隆形成能力高于對(duì)照組，其凋亡水平低于對(duì)照組，而干擾Sox9的肝癌細(xì)胞的克隆形成能力低于對(duì)照組，凋亡水平高于對(duì)照組。
　　在已構(gòu)

9、建的過(guò)表達(dá)及敲減細(xì)胞系中使用慢病毒轉(zhuǎn)染入luciferase，驗(yàn)證發(fā)光效率后使用Sox9過(guò)表達(dá)，Sox9干擾以及對(duì)照空病毒細(xì)胞構(gòu)建裸鼠的皮下荷瘤及尾靜脈注射模型，建模后每72小時(shí)按20mg/kg體重給予索拉菲尼灌胃處理。與不同觀察節(jié)點(diǎn)(0w，1w，3w，5w，7w)記錄裸鼠體內(nèi)熒光信號(hào)值，并于7w后取出皮下荷瘤的瘤體，計(jì)量體積并稱(chēng)重，分析不同處理組的腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)情況。結(jié)果:1、過(guò)表達(dá)Sox9組的裸鼠其皮下腫瘤的熒光值高于對(duì)照

10、組，7w后其腫瘤重量高于對(duì)照組，而干擾Sox9的裸鼠其體內(nèi)腫瘤熒光值低于對(duì)照組，7w后腫瘤重量低于對(duì)照組。2、在肺轉(zhuǎn)移模型中，過(guò)表達(dá)Sox9組的裸鼠肺內(nèi)腫瘤熒光值高于對(duì)照組，而干擾Sox9組的裸鼠體內(nèi)熒光信號(hào)值低于對(duì)照組。
　　第三部分 Sox9通過(guò)Akt通路影響肝細(xì)胞癌對(duì)索拉菲尼耐藥性
　　使用Sox9干擾的7721細(xì)胞系，以空病毒7721細(xì)胞系為對(duì)照進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片的檢測(cè)，檢測(cè)不同基因的表達(dá)情況。并使用Pathway分

11、析觀察基因在信號(hào)通路的富集清情況。之后使用免疫印跡驗(yàn)證差異基因的表達(dá)。結(jié)果:1、表達(dá)譜芯片顯示在Sox9干擾的細(xì)胞系中，下調(diào)的基因在TGF-β，mTOR，VEGF等通路的存在富集現(xiàn)象，其中與腫瘤耐藥密切相關(guān)的Akt通路亦存在下調(diào)基因的富集，此外作為Akt下游的耐藥基因，BCRP亦存在顯著下調(diào)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，HCC可以通過(guò)Oct4-Akt-BCRP產(chǎn)生對(duì)化療藥物的耐藥性。之后我們使用免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Akt/BCRP通路在Sox9過(guò)表達(dá)的

12、細(xì)胞系中上調(diào)，而在Sox9干擾細(xì)胞系中下調(diào)。2、免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在使用4μM索拉菲尼處理72小時(shí)后的肝癌細(xì)胞系中，其Sox9及BCRP的表達(dá)均顯著上升。
　　第四部分 Sox9通過(guò)Akt/BCRP影響HCC對(duì)于索拉菲尼的耐藥性
　　使用相應(yīng)的慢病毒構(gòu)建Sox9+/BCRP+/Sox9+BCRP-/NC的細(xì)胞系，使用4μM索拉菲尼體外培養(yǎng)后進(jìn)行Brdu，克隆形成及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。使用帶有Luciferase的7721細(xì)胞感染

13、相應(yīng)慢病毒從而構(gòu)建上述四種細(xì)胞系，使用這些細(xì)胞系構(gòu)建裸鼠的腫瘤細(xì)胞脾注射肝轉(zhuǎn)移模型，之后每72h給予索拉菲尼灌胃，使用活體成像儀記錄腫瘤熒光信號(hào)。結(jié)果顯示:1.在使用索拉菲尼后，Sox9+及BCRP+細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力較對(duì)照組高，而凋亡及壞死細(xì)胞的比例較對(duì)照組低，而Sox9+BCRP-細(xì)胞增殖能力及克隆形成能力較對(duì)照組減弱，凋亡及壞死的細(xì)胞比例較對(duì)照組高。2.Sox9+及/BCRP+的細(xì)胞系在裸鼠體內(nèi)的熒光值高于對(duì)照組，而Sox

14、9+BCRP-的細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的熒光值低于對(duì)照組。
　　結(jié)論:
　　根據(jù)上述結(jié)果，結(jié)合四部分內(nèi)容，可以總結(jié)得到:
　　1、肝細(xì)胞癌細(xì)胞系在使用索拉菲尼后，其Sox9的表達(dá)在mRNA水平或者蛋白水平均逐漸升高，且HCC細(xì)胞系中Sox9陽(yáng)性的細(xì)胞比例增高，由此可以推測(cè)Sox9升高有助于肝細(xì)胞癌提高對(duì)索拉菲尼的耐藥性，從而抵抗索拉菲尼對(duì)于其的殺傷作用。
　　2、過(guò)表達(dá)Sox9的肝癌細(xì)胞系在索拉菲尼的壓力下，較對(duì)照組細(xì)胞

15、活力高，增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞凋亡比例低。在皮下荷瘤及尾靜脈注射轉(zhuǎn)移的裸鼠模型中，Sox9過(guò)表達(dá)組的腫瘤在活體成像儀中的信號(hào)值更強(qiáng)，而干擾Sox9表達(dá)的肝癌細(xì)胞系則相反。由此可從另一面驗(yàn)證Sox9升高能夠提升肝細(xì)胞癌對(duì)索拉菲尼的耐藥性。
　　3、干擾Sox9的表達(dá)譜芯片提示Sox9可影響Akt/BCRP通路的表達(dá)，而Akt通路與索拉菲尼耐藥密切相關(guān)，所以Sox9可能通過(guò)調(diào)控Akt/BCRP通路影響肝細(xì)胞癌對(duì)于索拉菲尼的耐藥性。之后的拯救