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1、目的:
脂肪細(xì)胞分泌的瘦素與高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但機(jī)制不完全清楚。本研究采用不同濃度瘦素相同時(shí)間作用于大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(VSMCs),觀察瘦素對(duì)其環(huán)氧合酶-2(COX-2)及下游產(chǎn)物血栓素A2和前列環(huán)素的影響,以探討瘦素介導(dǎo)的高血壓的發(fā)病機(jī)制。
方法:
采用組織貼壁法原代培養(yǎng)VSMCs;通過(guò)免疫熒光組化檢測(cè)VSMCs內(nèi)特異性蛋白平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-actin)以鑒定VSMCs,不同濃度瘦素(10-
2、7、10-8、10-9、10-10、10-11M)同一時(shí)間(48h)作用于VSMCs后,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)VSMCs的COX-2mRNA的相對(duì)表達(dá);Westernblot檢測(cè)各組COX-2蛋白的相對(duì)表達(dá);酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Elisa)檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中6-酮前列腺素(6-KetoPGF1α)和血栓素B2(TXB2)的分泌程度。
結(jié)果:
1、VSMCs培養(yǎng)7天后,組織邊緣萌發(fā)出少量細(xì)胞,呈長(zhǎng)梭形和多邊形,培養(yǎng)15
3、天后,細(xì)胞呈明顯的“波峰波谷”樣改變。
2、免疫熒光檢測(cè)見(jiàn)培養(yǎng)的細(xì)胞漿中有特異性表達(dá)α-actin蛋白,通過(guò)計(jì)算得到表達(dá)α-actin的細(xì)胞陽(yáng)性率為90%,即培養(yǎng)的VSMCs的純度達(dá)90%。
3、與對(duì)照組(PBS處理)相比較,各梯度濃度瘦素處理48小時(shí)后,VSMCs的COX-2mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P<0.05),而在低中濃度瘦素水平時(shí)(10-11M、10-10M、10-9M)隨著濃度增加COX-2呈逐
4、漸上升趨勢(shì)(10-10M相當(dāng)于生理濃度),當(dāng)瘦素水平達(dá)高濃度(10-8M、10-7M)后VSMCs的COX-2mRNA及蛋白二者相對(duì)表達(dá)量逐漸降低(10-9M為出現(xiàn)瘦素抵抗的濃度)。
4、細(xì)胞上清液中6-KetoPGF1α水平的表達(dá)趨勢(shì)與COX-2基本一致,即與對(duì)照組(PBS處理)相比較,各梯度濃度瘦素處理48小時(shí)后,VSMCs分泌的6-KetoPGF1α蛋白表達(dá)量均明顯升高(P<0.05),而在低中濃度瘦素水平時(shí)(10-11
5、M、10-10M、10-9M)隨著濃度的增加6-KetoPGF1α呈逐漸上升趨勢(shì);當(dāng)瘦素水平達(dá)高濃度后(10-8M、10-7M),6-KetoPGF1α表達(dá)量反而下降??赡艿脑颍孩偈菟囟拘宰饔?,促進(jìn)平滑肌的壞死和凋亡,降低COX-2和6-KetoPGF1α的表達(dá);②瘦素抵抗,有研究認(rèn)為瘦素在體內(nèi)超過(guò)一定濃度時(shí),反饋性的下調(diào)瘦素受體的表達(dá)。
5、細(xì)胞上清液中TXB2的表達(dá)無(wú)顯著差異,TXB2/6-KetoPGF1α比值也無(wú)顯著
6、差異,因此瘦素對(duì)VSMCs分泌的TXB2及TXB2/6-KetoPGF1α無(wú)顯著影響(P>0.05)。
結(jié)論:
瘦素明顯增加VSMCs的炎癥因子COX-2表達(dá),這可能與高血壓(是一種慢性炎癥疾病)的發(fā)生發(fā)展有關(guān);瘦素明顯增加COX-2的下游產(chǎn)物舒張血管物質(zhì)6-KetoPGF1α的表達(dá),這又利于血壓下降,說(shuō)明瘦素對(duì)VSMCs的作用具有復(fù)雜性;選擇性COX-2抑制劑因在抑制COX-2的同時(shí)也可能抑制其下游6-KetoPG
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