環(huán)氧合酶抑制劑塞來昔布對神經(jīng)膠質瘤細胞促血管新生作用及其血管生成素-2表達的影響.pdf

1、腫瘤是典型的血管依賴性病變，腫瘤的惡性生長和轉移依賴于腫瘤血管新生。腫瘤血管新生是在多種因素的嚴密調控下進行的，是促進血管新生因素和抑制血管新生因素間失衡的結果。新生的腫瘤血管增加腫瘤的血液灌注，促進腫瘤生長、浸潤和轉移。目前以腫瘤血管新生為靶點的治療已成為腫瘤治療研究領域的主要方向之一。 環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是催化花生四烯酸轉化為前列腺素的關鍵酶，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。血管生成

2、素-2(angiopoietin-2，-Ang-2)可特異性作用于血管內皮細胞，在血管生成及維持血管平衡中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑可抑制腫瘤生長，增加腫瘤組織壞死。但其對腫瘤細胞中血管生成素-2表達的影響國內尚無報道。本實驗在體外培養(yǎng)人臍帶靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)和人神經(jīng)膠質瘤細胞，應用Matrigel建立血管形成的體外培養(yǎng)體系，來研究塞來昔布

3、對腫瘤細胞誘導血管形成及腫瘤細胞中血管生成素表達的影響，進而探討塞來昔布與腫瘤血管新生的關系及其作用機制。 方法： 采用改進的Jaffe氏培養(yǎng)法進行HUVECs培養(yǎng)，應用Matrigel誘導內皮細胞形成管腔結構，建立血管形成的體外培養(yǎng)體系，然后施加實驗因素。體外分離培養(yǎng)人神經(jīng)膠質瘤細胞，待細胞達到亞融合狀態(tài)后，制備腫瘤細胞條件培養(yǎng)液。以二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)為溶劑將塞來昔布制成20μ

4、m/l、40μm/l、60μm/l三種濃度試劑。實驗分兩部分，第一部分觀察HUVECs在Matrigel上形成管腔結構的情況。分三組，第一組實驗分為對照組(無血清DMEM培養(yǎng)液)和不同濃度的腫瘤細胞條件培養(yǎng)液作用組(腫瘤細胞上清液與DMEM培養(yǎng)液比分別為1：2、1：1、2：1)，作用24小時。第二組為塞來昔布濃度效應組(20μm/l、401μm/l、60μm/l)對照組加入二甲基亞砜。第三組為塞來昔布時間效應組(12h、24h、48h)

5、對照組加入二甲基亞砜。第二部分檢測Ang-2蛋白的表達，同樣分塞來昔布濃度效應組和塞來昔布時間效應組。各試驗組用倒置相差顯微鏡觀察、照相，然后用95％冰乙醇固定，進行GFAP和Ang-2免疫細胞化學染色。采用光學顯微鏡下計數(shù)管腔數(shù)及計算機圖像分析對結果進行測定。最后用統(tǒng)計學方法進行分析。 結果： 腫瘤細胞條件培養(yǎng)液作用于培養(yǎng)的HUVECs后，培養(yǎng)體系的管腔數(shù)增多。塞來昔布作用后培養(yǎng)體系的管腔數(shù)減少，且在一定范圍內呈劑量和

6、時間依賴效應(P<0.01)；隨培養(yǎng)體系的管腔數(shù)減少，神經(jīng)膠質瘤細胞Ang-2表達減少，且在一定范圍內呈劑量和時間依賴效應(P<0.01)。 討論： 環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)由細胞因子、生長因子和腫瘤促進因子誘導產(chǎn)生，在炎癥和腫瘤組織中過表達。COX-2存在增殖性細胞、內皮細胞和間質細胞中，能促進腫瘤血管新生和腫瘤生長，因此選擇性COX-2抑制劑對惡性實體瘤的治療是一種有前景的治療方法

7、。但COX-2抑制劑對人神經(jīng)膠質瘤的作用以前未見報道。本實驗主要目的是明確選擇性COX-2抑制劑對人神經(jīng)膠質瘤誘導的血管新生及Ang-2表達的影響。 腫瘤的血管新生是受血管新生因子和血管新生抑制因子的調節(jié)。在體內，腫瘤的血管新生因子主要來源于腫瘤細胞，由腫瘤細胞釋放，作用于血管內皮細胞，促其增生形成新生血管。本實驗觀察到腫瘤條件培養(yǎng)液作用于培養(yǎng)的HUVECs后培養(yǎng)體系的管腔數(shù)增多，且在一定范圍內呈劑量依賴效應。推測腫瘤細胞可通過

8、分泌某些促血管新生因子促進腫瘤血管新生。我們在培養(yǎng)體系中加入不同濃度的塞來昔布溶液及用其作用不同時間，治療組與對照組相比管腔數(shù)明顯減少且在一定范圍內呈劑量及時間依賴效應。 Ang-2是血管生成素(angiogenin)家族中的一員。腫瘤細胞在缺氧條件下分泌較多的VEGF和Ang-2，并使Ang-2在VEGF的協(xié)同作用下，促進腫瘤壞死組織周圍新生血管的形成。在本實驗中我們觀察到治療組與對照組相比Ang-2的表達明顯減少且在一定范圍

9、內呈劑量及時間依賴效應。提示塞來昔布作為一種選擇性COX-2抑制劑可通過COX-2依賴途徑在蛋白水平上抑制神經(jīng)膠質瘤細胞分泌Ang-2，從而抑制腫瘤血管新生。 結論： 1、腫瘤細胞可以促進Matrigel體外誘導人血管內皮細胞的血管形成，并在一定范圍內呈劑量依賴效應。 2、塞來昔布可以抑制人神經(jīng)膠質細胞促血管新生作用，并在一定范圍內呈劑量及時間依賴效應。 3、塞來昔布可以下調人神經(jīng)膠質細胞中Ang-2表達