青島文昌魚體液補體介導弧菌溶菌活性及弧菌逃避補體攻擊機制的研究.pdf

1、補體的系統(tǒng)發(fā)育進化是當今免疫學研究熱點之一。比較免疫學研究表明脊椎動物和無脊椎動物補體系統(tǒng)有著共同的祖先。在過去10年里，在無脊椎動物后口類、甚至原口類中，結構和功能相似的一些重要補體組分如C3和B因子已經得到了鑒定，但有關這些動物補體功能的研究相當有限。文昌魚(Amphioxus)是介于無脊椎動物和脊椎動物之間的過渡類型，是研究脊椎動物進化的珍貴材料。本文選擇了在系統(tǒng)演化上占據重要地位的文昌魚，對其體液補體介導弧菌溶菌活性進行研究，并

2、對弧菌逃避補體攻擊機制進行探討。 本文首次將測定脊椎動物血清補體溶茵活性的標準方法運用到文昌魚體液免疫研究中，對文昌魚體液補體的溶菌活性進行研究。通過文昌魚體液與弧菌相作用，文昌魚體液能夠在體外抑制溶藻膠弧菌HW284(Vibrio alginolyticus HW284)、副溶血弧菌HW458(Vibrio parahaemolyticus HW458)、哈維氏弧菌SF-1(Vibrio harvey SF-1)的生長，存活

3、率分別為42％，28％和59％。這樣的數據在無脊椎動物的后口類尚屬首次。掃描電鏡觀察表明正常文昌魚體液存在溶菌活性，例如，能溶解溶藻膠弧菌HW284，而經滅活的體液及無菌過濾海水處理的溶藻膠弧菌HW284表面光滑，細胞完整。用熱滅活的兔抗人C3血清處理文昌魚體液后，再與溶藻膠弧菌HW284相作用，體液溶菌活性明顯降低，而經免疫前的兔血清或PBS處理的體液，溶菌活性不受影響，此外，體液經熱處理(45℃，30 min)和反復凍融處理后，文昌

4、魚體液抑制溶藻膠弧菌HW284生長的活性明顯降低，其存活率分別為89％和81％，而正常體液(對照組)作用后，弧菌的生長不受影響。這些結果表明補體作用可能是抑制弧菌生長的主要因素。40 mMEGTA(包含4mM MgCl2)處理的文昌魚體液沒有影響溶菌活性，與正常體液(對照組)相比，具有相似的溶菌活性，其存活率分別為42％和44％，在EGTA處理組中添加10mM CaCl2，沒有增強體液的溶菌活性，相反，用40mM EDTA處理文昌魚體液

5、，體液的溶菌活性消失，其存活率為86％，在EDTA處理中添加4 mM MgCl2，恢復了體液的溶菌活性，這些實驗結果表明文昌魚體液補體介導的溶菌活性依賴Mg2+，而不依賴Ca2+。另外，用補體替代途徑的選擇性激活劑-酵母聚糖A處理后的文昌魚體液，再與溶藻膠弧菌HW284相作用，體液溶菌活性明顯降低，與未處理的體液相比，在2倍稀釋的體液中，其存活率分別為82％和43％，這些實驗結果強烈暗示著補體替代途徑的激活與文昌魚體液的溶菌活性相關。

6、 值得注意的是，7種弧菌中，其中4種弧菌-河弧菌HW293(Vibrio furnissi HW293)、辛辛那提弧菌HW287(Hbrio cincinnatiensis HW287)、鰻弧菌W-1(Vibrio anguillarum W-1)和哈維氏弧菌Z3G2(Vibrio harveyi Z3G2)能夠抵制文昌魚體液補體介導的溶菌作用。本文首次將脊椎動物血清補體消耗標準測定方法運用到文昌魚溶菌功能研究中，使用蛋白酶K消

7、化法分別提取辛辛那提弧菌HW287和溶藻膠弧菌HW284的LPS，經12％SDS-PAGE電泳、銀染色后，發(fā)現辛辛那提弧菌HW287 LPS既有高分子量的O-抗原又有低分子量的O-抗原的梯狀帶結構，而溶藻膠弧菌HW284幾乎沒有高分子量的O-抗原帶。高分子量的o-抗原缺乏是與溶藻膠弧菌HW284對文昌魚體液敏感相一致的。而辛辛那提弧菌HW287具有許多高分子量的O-抗原呈現出補體抵制，表明O-抗原的大小與體液抵制之間是正相關的。此外，用