隔山香化學(xué)成分及對大鼠胸主動脈舒張作用的研究.pdf

1、目的:
　　草藥隔山香(Ostericum citriodorum(Hance)Yuan et Shan）為傘形科山芹屬植物，是我國特有物種，具有“活血化瘀，行氣止痛”的功效。本課題組前期通過研究發(fā)現(xiàn)隔山香各極性部位萃取物（石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物）均具有舒張血管的活性，并發(fā)現(xiàn)石油醚萃取物中分離得到的異芹菜腦有一定的內(nèi)皮依賴性的血管舒張作用;而同時，研究發(fā)現(xiàn)隔山香乙酸乙酯萃取物對離體大鼠胸主動脈內(nèi)皮完整或內(nèi)皮去除

2、血管均有一定的舒張，且無差異。提示隔山香中還含有其它不同于異芹菜腦的具有非內(nèi)皮依賴性血管舒張活性的化合物，基于此，本實驗延續(xù)前期研究，對乙酸乙酯部位進行植化分離，采用離體血管灌流裝置考察從乙酸乙酯萃取物中分離得到的化合物異紫花前胡內(nèi)酯(marmesin)對預(yù)收縮離體大鼠胸主動脈血管環(huán)的舒張效果及作用機制;并結(jié)合激光共聚焦顯微鏡，考察其對血管平滑肌細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。從器官水平到細胞水平研究異紫花前胡內(nèi)酯的血管舒張活性，以進一步闡釋隔

3、山香“行氣止痛”的科學(xué)內(nèi)涵，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法:
　　1、隔山香乙酸乙酯萃取物的植化分離:采用硅膠柱、ODS柱、Sephadex LH-20、制備液相等分離手段，同時使用TLC、HPLC等方法檢測合并相同組分，進行反復(fù)分離及純化，并以ESI-MS（或HR-ESI-MS）、1H-NMR、13C-NMR和DEPT等方法對化合物結(jié)構(gòu)進行鑒定，并與文獻比對。
　　2、異紫花前胡內(nèi)酯對血管的舒張作用:①采用離體血管環(huán)

4、灌流實驗裝置，觀察異紫花前胡內(nèi)酯（25、50、100μg/mL）對去甲腎上腺素(NE)和氯化鉀(KCl)預(yù)收縮內(nèi)皮完整或內(nèi)皮去除的血管以及靜息狀態(tài)下血管張力的影響。②異紫花前胡內(nèi)酯對外鈣內(nèi)流的影響:在無鈣Kreb's液(含0.5 mM EGTA)中，考察異紫花前胡內(nèi)酯（100μg/mL）對氯化鈣量效曲線的影響;③異紫花前胡內(nèi)酯對離子通道的影響:在Kreb's液中，分別以維拉帕米、TEA預(yù)孵內(nèi)皮去除血管，考察其對異紫花前胡內(nèi)酯血管舒張效果

5、的影響。④異紫花前胡內(nèi)酯對內(nèi)鈣離子釋放的影響:無鈣Kreb's液(含0.5 mM EGTA)中，以異紫花前胡內(nèi)酯預(yù)先孵育血管15min，NE刺激血管引起血管收縮，比較給藥孵育與給DMSO孵育血管的收縮。
　　3、異紫花前胡內(nèi)酯對血管平滑肌細胞A7r5細胞胞漿內(nèi)鈣離子濃度的影響:以鈣離子熒光探針Fluo-3，AM負載細胞，結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)實時測定胞質(zhì)內(nèi)[Ca2+]i的變化，分別考察異紫花前胡內(nèi)酯對氯化鉀(KCl)

6、、去甲腎上腺素(NE)及氯化鈣(CaCl2)誘導(dǎo)的胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高的影響。
　　結(jié)果:
　　1、從乙酸乙酯部位暫分得6個化合物，已鑒定出5個，另一個結(jié)構(gòu)待解析。已鑒定出的化合物中有一個為新的天然產(chǎn)物，暫命名為8-(3，7-Dimethyl-octa-2，6-dienyl)-7-hydroxy-6-methoxy-chromen-2-one。另4個分別為Decursidin、9-angeloyloxy-10-senecio

7、yloxy-9，10-dihydroxanthyletin、4，5-二甲氧基-2，3-亞甲二氧基苯甲醇、異紫花前胡內(nèi)酯，其中異紫花前胡內(nèi)酯為首次從隔山香中分離得到。
　　2、異紫花前胡內(nèi)酯能濃度依賴性舒張NE以及KCl預(yù)收縮的內(nèi)皮完整或內(nèi)皮去除的血管(P＜0.05)，且內(nèi)皮完整組與內(nèi)皮去除組均無明顯差異;同時對靜息狀態(tài)下血管張力無影響。異紫花前胡內(nèi)酯能使氯化鈣量效曲線顯著下移(P＜0.05);以維拉帕米、TEA預(yù)孵后異紫花前胡內(nèi)酯

8、血管舒張作用有所降低(P＜0.05)。
　　3、不同濃度的異紫花前胡內(nèi)酯預(yù)孵血管平滑肌細胞后，KCl、NE及CaCl2誘導(dǎo)的細胞熒光密度值明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、從乙酸乙酯部位分得6個化合物，主要為苯丙素類。其中一個為新的天然產(chǎn)物，暫命名為8-(3，7-Dimethyl-octa-2，6-dienyl)-7-hydroxy-6-methoxy-chromen-2-one;其余分別為decursi

9、din、9-angeloyloxy-10-senecioyloxy-9，10-dihydroxanthyletin、4，5-二甲氧基-2，3-亞甲二氧基苯甲醇、異紫花前胡內(nèi)酯。
　　2、異紫花前胡內(nèi)酯可能是通過直接作用與血管平滑肌舒張血管的，且舒張作用具有濃度依賴性。其舒血管機制可能與抑制血管平滑肌上ROCC、VOCC活性，阻斷L型鈣離子通道、開放鈣激活鈣通道(KCa)，以及抑制內(nèi)鈣離子釋放等有關(guān)。
　　3、異紫花前胡內(nèi)酯可