龍葵堿增強肺腺癌細胞對順鉑和X射線敏感性及其機制研究.pdf

1、背景和目的：
　　肺癌是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的首要原因。其中，肺腺癌作為肺癌的一種重要亞型，其發(fā)病率逐年增加，嚴重威脅人類的健康。肺腺癌的放化療敏感性普遍較差，盡管近年來其治療取得了一些進展，但并沒有明顯改善患者的生存率。因此探尋新的治療方法，以及提高傳統(tǒng)放化療的治療效果就成為一個重要的課題。
　　近年來，小分子抗腫瘤化合物的在腫瘤防治中的作用受到廣泛的關(guān)注。例如楊梅黃酮，生物堿苷類物質(zhì)等，這些小分子化合物能夠通過多樣化的

2、機制影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，或改變腫瘤細胞的放化療敏感性，為腫瘤的治療提供了新的思路與方法。龍葵堿（又名α-茄堿，α-solanine）是一種具有生物活性的甾體配糖生物堿，常見于馬鈴薯塊莖和其它茄屬植物中?，F(xiàn)有研究已經(jīng)證實龍葵堿能夠通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，因此有必要從抑制腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，以及對腫瘤細胞放化療敏感性的影響等多個方面對其抗腫瘤作用進行研究。
　　腫瘤發(fā)生發(fā)展及治療等均受到復雜的分子機制的調(diào)控和影響。其中miRNA

3、是一類非編碼的小RNA分子，通常具有18-24個堿基大小，能夠通過與mRNA特定位點的作用來調(diào)節(jié)靶基因的表達，進而在多種生物學過程中發(fā)揮調(diào)控作用，例如調(diào)控腫瘤的遷移和侵襲，影響腫瘤的放療、化療敏感性等。近年來有研究指出龍葵堿能夠通過 miRNAs作用于下游一些功能性的靶基因，進而影響腫瘤細胞的侵襲和遷移能力以及放化療敏感性等。
　　本研究將分兩部分對龍葵堿在肺腺癌中的抗腫瘤作用進行探索：第一部分，龍葵堿對肺腺癌細胞的侵襲能力和細胞

4、對順鉑和X射線敏感性的影響；第二部分，龍葵堿增強肺腺癌細胞對順鉑和X射線的敏感性的機制探索。
　　第一部分龍葵堿增強肺腺癌細胞對順鉑和X射線的敏感性
　　方法:
　　1.運用MTT方法測定龍葵堿對兩種肺腺癌細胞株A549細胞和H1299細胞的細胞毒性。
　　2. Transwell實驗評價龍葵堿對 A549細胞和H1299細胞遷移和侵襲能力的影響。利用實時熒光定量RT-PCR和Western blot檢測肺腺癌侵

5、襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP-2，MMP-9和TIMP-1的表達。
　　3.運用MTT方法，通過檢測龍葵堿和順鉑聯(lián)合應用對肺腺癌細胞生長的抑制作用，評價龍葵堿對肺腺癌細胞順鉑敏感性的影響。
　　4.利用克隆形成實驗，通過檢測龍葵堿與X射線聯(lián)合應用對肺腺癌細胞生長的抑制作用，評價龍葵堿對肺腺癌細胞X射線敏感性的影響。
　　5.裸鼠移植瘤實驗檢測龍葵堿作用后，移植瘤對順鉑和X射線的敏感性的變化。收集移植瘤標本，運用實時熒光定量R

6、T-PCR及Western blot檢測瘤體內(nèi)放化療增敏相關(guān)基因PDCD4，PTEN，Cdk2，F(xiàn)AK的表達情況。
　　6.統(tǒng)計學分析：對得到的數(shù)據(jù)應用統(tǒng)計學軟件SPSS22.0進行統(tǒng)計分析，利用LSD-t檢驗進行兩組數(shù)據(jù)間的比較，單因素方差分析進行多組數(shù)據(jù)間的比較；對于計量資料，應用t檢驗進行檢測；以α=0.05為顯著性水準。
　　結(jié)果
　　1.MTT結(jié)果顯示15μmol/L龍葵堿對A549和H1299細胞均有明顯的

7、細胞毒性（P<0.05），而低濃度的龍葵堿對A549和H1299細胞無明顯的細胞毒性。2.Transwell實驗結(jié)果顯示低濃度的龍葵堿（3μmol/L，6μmol/L）能抑制A549和H1299細胞的遷移和侵襲能力。實時熒光定量RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示低濃度龍葵堿能夠引起腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9表達下降，而TIMP-1的表達增加（P<0.05）。
　　3. MTT檢測及克隆形成實驗提示低濃

8、度龍葵堿能夠增強順鉑和放射線對A549和H1299細胞的抑制作用。
　　4.荷瘤小鼠實驗顯示龍葵堿能在體內(nèi)試驗水平增強移植瘤組織對順鉑和X射線的敏感性（P<0.05）。實時熒光定量RT-PCR和Western blot對幾種常見的放化療增敏相關(guān)基因的檢測結(jié)果顯示龍葵堿能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平下調(diào)FAK的表達（P<0.05）。
　　第二部分龍葵堿增強肺腺癌細胞對順鉑和X射線敏感性的機制研究
　　方法:
　　1.應用實時

9、熒光定量RT-PCR檢測3μmol/L和6μmol/L龍葵堿在不同時間點對肺腺癌細胞株A549和H1299細胞中FAK基因mRNA表達的影響，Western blot檢測細胞中FAK蛋白的表達。
　　2.應用TargetScan及 miRanda等生物信息學軟件分析調(diào)控 FAK基因的上游miRNA。
　　3.應用實時熒光定量RT-PCR檢測3μmol/L和6μmol/L龍葵堿對A549和H1299細胞中miR-138表達水平

10、的影響。
　　4.運用Pearson相關(guān)性分析分析細胞中miR-138和FAK mRNA表達水平的相關(guān)性。
　　5.應用Overlap PCR方法擴增突變型FAK3’UTR片段，并應用PCR擴增野生型FAK3’ UTR片段，構(gòu)建野生型及突變型FAK3’ UTR的重組雙熒光素酶報告基因載體，分別與合成的miR-138 mimics或者miR-138 scramble共轉(zhuǎn)染入A549細胞中，應用雙熒光素酶報告實驗證實FAK為mi

11、R-138的靶基因。
　　6.使用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將合成的miR-138 mimics或者miR-138 scramble分別轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長期的A549和H1299細胞，并設立空白對照組。實時熒光定量RT-PCR方法檢測各實驗組A549和H1299細胞中miR-138的表達情況。Transwell實驗檢測各實驗組A549和H1299細胞的遷移和侵襲能力的變化。MTT法檢測不同濃度順鉑對各組細胞增殖能力

12、的抑制作用，評價上調(diào)miR-138的表達對細胞順鉑敏感性的影響?？寺⌒纬蓪嶒灆z測不同劑量射線對各組細胞增殖能力的抑制作用，評價上調(diào)miR-138的表達對細胞放療敏感性的影響。應用實時熒光定量RT-PCR和Western blot檢測各組細胞放化療敏感性相關(guān)基因FAK的表達變化。
　　7.構(gòu)建無3’UTR區(qū)的FAK表達載體，與miR-138 mimics共轉(zhuǎn)染或者單獨轉(zhuǎn)染入A549細胞，設立空白對照組以及3μmol/L龍葵堿作用組，

13、應用Restore實驗分析miR-138靶向調(diào)控FAK表達的作用機制。
　　8.合成靶向FAK基因的特異性siRNA，采用MTT實驗和克隆形成實驗分析比較siRNA-FAK、龍葵堿和miR-138對順鉑和X射線作用于A549細胞的敏感性的變化。
　　9.統(tǒng)計學分析：使用SPSS22.0軟件對得到的實驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果:
　　1.低濃度龍葵堿抑制肺腺癌細胞株A549和H1299細胞中FAK mRNA和蛋

14、白的表達水平。
　　2.生物信息學軟件分析以及進一步的雙熒光素酶報告實驗證實miR-138靶向作用于FAK基因。
　　3.低濃度龍葵堿誘導A549和H1299細胞中miR-138的表達。
　　4.Pearson相關(guān)性分析提示miR-138和FAK mRNA表達呈負相關(guān)。
　　5. Transwell實驗結(jié)果顯示，相較Scramble組和Blank組，miR-138組A549和H1299細胞的遷移和侵襲能力均明顯下

15、降（P<0.05）。
　　6. MTT實驗和克隆形成實驗結(jié)果顯示，與Scramble組和Blank組相比，miR-138組順鉑和射線的LC50明顯降低，A549和H1299細胞對順鉑和X射線的敏感性明顯增加（P<0.05）。
　　7.Western blot結(jié)果表明，相對于Scramble組和Blank組，miR-138組細胞FAK表達水平明顯降低（P<0.05）。
　　8.Restore實驗顯示，無3’ UTR區(qū)的F

16、AK的表達不受miR-138的調(diào)控，并且其作用可以覆蓋上調(diào)miR-138表達后對A549細胞順鉑和X射線的增敏作用。
　　9.向A549細胞中轉(zhuǎn)染siRNA-FAK，過表達miR-138，以及加入3μmol/L龍葵堿，其作用無顯著差異，進一步提示了龍葵堿可上調(diào)細胞中miR-138的表達，而miR-138進一步作用于FAK的3’ UTR區(qū)，負向調(diào)控FAK蛋白的表達，從而增強肺腺癌細胞對順鉑和X射線的敏感性。
　　結(jié)論：