RAD18基因敲除通過抑制FA-BRCA通路增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性.pdf

1、目的:應(yīng)用siRNA手段敲除人肺非小細(xì)胞肺癌A549/DDP細(xì)胞株（順鉑耐藥A549細(xì)胞株）和A549細(xì)胞株的E3泛素連接酶RAD18基因后，研究該處理對(duì)順鉑敏感性變化產(chǎn)生的影響，探討非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥機(jī)制中FA/BRCA通路的作用。
　　方法:訂購針對(duì)RAD18基因的siRNA(RAD18-siRNA)，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將RAD18-siRNA分別導(dǎo)入人肺非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549/DDP和A549細(xì)胞株達(dá)到基因敲除目的

2、，蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）檢測(cè)經(jīng)順鉑處理后，這一對(duì)細(xì)胞株轉(zhuǎn)染處理前后RAD18蛋白的表達(dá)水平從而驗(yàn)證該基因是否被沉默。CCK-8法用于測(cè)定RAD18基因敲除前后，經(jīng)順鉑處理的這一對(duì)細(xì)胞株的增殖率變化情況;Western Blotting分別測(cè)定RAD18基因敲除前后，這一對(duì)細(xì)胞株FANCD2蛋白單泛素化程度的變化;應(yīng)用免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)RAD18基因敲除前后，這一對(duì)細(xì)胞株胞核內(nèi)FANCD2核聚小體的形成狀態(tài);A

3、nnexinⅤ/PI雙染，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定RAD18基因敲除前后這一對(duì)細(xì)胞株經(jīng)質(zhì)量濃度為10μg/mL的順鉑處理48小時(shí)，早期凋亡率的變化。
　　結(jié)果:(1)與轉(zhuǎn)染前相比，RAD18-siRNA轉(zhuǎn)染后A549/DDP和A549細(xì)胞的RAD18蛋白表達(dá)量明顯降低(P＜0.05)，證明RAD18-siRNA轉(zhuǎn)染有效，該基因被成功敲除。(2)RAD18基因敲除前后的A549/DDP和A549細(xì)胞增殖率變化呈劑量依賴性，隨順鉑濃度的增加

4、而明顯下降，不同時(shí)間點(diǎn)的不同濃度之間，其細(xì)胞增殖率之間均存在差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對(duì)于RAD18基因敲除后的A549/DDP以及A549細(xì)胞，除了經(jīng)0和1.25μg/mL這兩個(gè)濃度的順鉑處理外，其余各濃度順鉑處理后的細(xì)胞增殖率在24 h和48 h均明顯低于基因未敲除時(shí)的細(xì)胞增殖率(P＜0.05)。(3) RAD18基因敲除后的A549/DDP和A549這一對(duì)細(xì)胞經(jīng)順鉑處理24h和48h的IC50值（半數(shù)抑制濃度）較基

5、因未敲除前顯著降低(P＜0.05）。(4) RAD18基因敲除后，A549/DDP和A549這一對(duì)細(xì)胞株的FANCD2蛋白的表達(dá)水平明顯下降（P均＜0.05），結(jié)果暗示了這一對(duì)肺癌細(xì)胞FA/BRCA通路的核心蛋白FANCD2合成呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)。同時(shí)敲除該基因后，除A549細(xì)胞在10μg/mL順鉑濃度處理24 h的FANCD2-L/S比值與未敲除時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（t=2.457，P=0.070），其余各濃度順鉑處理的這一對(duì)肺癌細(xì)胞24

6、h后的FANCD2-L/S比值均較未敲除時(shí)明顯降低（均P＜0.05），實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)過RAD18基因敲除后，F(xiàn)ANCD2的單泛素化程度顯著下降。(5)免疫熒光顯色結(jié)果表明，A549/DDP和A549這一對(duì)細(xì)胞株經(jīng)過濃度為5μg/mL順鉑處理24h和48h以后，細(xì)胞核中FANCD2核聚小體的形成增多，提示核聚小體形成;RAD18基因敲除后，這一對(duì)細(xì)胞株經(jīng)過濃度為5μg/mL順鉑處理24 h時(shí)的細(xì)胞核內(nèi)FANCD2核聚小體形成減少，表明這兩個(gè)肺

7、癌細(xì)胞株FA/BRCA通路的激活受到抑制。(8)AnnexinⅤ/PI雙染，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定結(jié)果顯示，分別敲除A549/DDP和A549細(xì)胞內(nèi)RAD18基因后，用10μg/mL順鉑處理48 h的細(xì)胞早期凋亡率較未敲除時(shí)明顯增加（P均＜0.05），表明該基因敲除后順鉑對(duì)這兩個(gè)肺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性明顯增強(qiáng)。
　　結(jié)論:應(yīng)用RNA干擾技術(shù)分別敲除A549/DDP和A549細(xì)胞的RAD18基因，可以通過下調(diào)FANCD2的單泛素化程度，阻斷FA