黃曲條跳甲對(duì)毒死蜱的敏感性及相關(guān)酶基因的克隆.pdf

1、黃曲條跳甲是十字花科蔬菜的主要害蟲之一，其抗藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重。本論文對(duì)黃曲條跳甲不同種群對(duì)毒死蜱的敏感性及酶活性進(jìn)行測(cè)定，并克隆了酯酶基因和乙酰膽堿酯酶基因，有助于抗性酶性質(zhì)的深入研究、殺蟲劑合理設(shè)計(jì)，為黃曲條跳甲的抗性治理提供必要的科學(xué)依據(jù)。 采用生物測(cè)定方法測(cè)定黃曲條跳甲2個(gè)室內(nèi)實(shí)驗(yàn)種群(蔊菜實(shí)驗(yàn)種群、上海青實(shí)驗(yàn)種群)和1個(gè)田間自然種群對(duì)毒死蜱的LC50值，結(jié)果表明，蔊菜實(shí)驗(yàn)種群對(duì)毒死蜱的LC50值最低，為30.3459 m

2、g/L；田間自然種群對(duì)毒死蜱的LC50值最高，為77.8448 mg/L，敏感性指數(shù)為0.39。對(duì)不同種群黃曲條跳甲乙酰膽堿酯酶(AChE)、羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的活性測(cè)定結(jié)果表明，黃曲條跳甲田間自然種群AChE活性最低，與蔊菜實(shí)驗(yàn)種群、上海青實(shí)驗(yàn)種群相比，差異極顯著(P<0.01)；田間自然種群GSTs活性最高，與蔊菜實(shí)驗(yàn)種群、上海青實(shí)驗(yàn)種群相比，差異極顯著(P<0.01)；黃曲條跳甲田間自然種群Car

3、E活性最高，蔊菜實(shí)驗(yàn)種群CarE活性最低，二者差異極顯著(P<0.01)；說(shuō)明毒死蜱對(duì)乙酰膽堿酯酶的活性有抑制作用，CarE、GST活性的提高可能促進(jìn)黃曲條跳甲對(duì)毒死蜱產(chǎn)生抗藥性。 根據(jù)己發(fā)表的酯酶基因和乙酰膽堿酯酶基因核苷酸序列及氨基酸序列的保守區(qū)域，分別設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，利用反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的方法對(duì)黃曲條跳甲酯酶基因和乙酰膽堿酯酶基因的保守序列片段進(jìn)行克隆和序列分析，結(jié)果得到酯酶基因281 bp的

4、目的片段和乙酰膽堿酯酶基因406 bp的目的片段。 利用3'-RACE技術(shù)獲得酯酶基因的3'端(1468 bp)，編碼442個(gè)氨基酸，核苷酸序列同源性分析表明，與赤擬谷盜Tribolium castaneum estl基因和雜擬谷盜Triboliumconfusum estl基因的同源性最高，為71％(211/297)，與果蠅Drosophila melanoqaster alpha-esterase5的同源性為70％(156/

5、222)，氨基酸序列與雜擬谷盜、赤擬谷盜、果蠅的酯酶基因的同源性分別為43％(188/434)、43％(188/434)、33％(144/432)。從BLAST結(jié)果可初步推測(cè)該片段應(yīng)為編碼黃曲條跳甲酯酶基因的部分核苷酸序列，該序列在GenBank中的登錄號(hào)為EU166919。 乙酰膽堿酯酶基因目的片段的核苷酸序列同源性分析表明，與馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata AChE的同源性最高，為75％(303/

6、402)；與褐飛虱Nilaparvatalugens ACHE2同源性為73％(300/407)；與其它20種昆蟲的AChE基因同源性均為68％以上，氨基酸序列與馬鈴薯甲蟲，棉鈴蟲，桑蠶的AChE基因的同源性分別為87％(119/136)，83％(114/136)，83％(114/136)。從BLAST結(jié)果可初步推測(cè)試驗(yàn)所獲得的406bp片段應(yīng)為編碼黃曲條跳甲AChE基因的部分核苷酸序列，該序列在GenBank中的登錄號(hào)為EUl6945