有機磷農(nóng)藥毒死蜱降解菌玫瑰紅紅球菌mpd基因的克隆.pdf

1、毒死蜱是一種廣譜性有機磷殺蟲劑，被廣泛用于農(nóng)業(yè)和城市衛(wèi)生害蟲的防治。同時毒死蜱也是一種持久性污染物，其殘留對環(huán)境和人類健康有很大的危害。尋求高效、安全、經(jīng)濟的農(nóng)藥殘留生物降解處理新技術，解決病蟲害防治用藥與農(nóng)藥殘留的矛盾，是科研工作者需要迫切解決的科研命題。本實驗對已分離得到的毒死蜱高效降解菌，玫瑰紅紅球菌（Rhodococcus thodochrous） HW-D3菌株，進行降解基因的克隆，為構建基因工程菌做好前期研究。
　　

2、 實驗采用SDS-蛋白酶K法提取D3菌基因組DNA，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)有明顯的RNA污染，加1μl RNase酶后可有效去除RNA，所提取基因組DNA片段大于15kb。用紫外可見分光光度計測基因組DNA的OD260為0.102、OD280為0.055，經(jīng)計算，濃度為0.5151μg/ul；其OD260/OD280為1.8545，在1.8～2.0之間，沒有蛋白質(zhì)和RNA的污染。由此可看出本研究制備的基因組的DNA片段完整、純度

3、高、濃度大，可以滿足構建基因組文庫的要求。采用同樣的方法分別提取培養(yǎng)12 h、24 h、36 h的D3菌基因組DNA，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，培養(yǎng)24h所提的基因組條帶最亮。
　　 本研究采用能切割4個核苷酸序列的內(nèi)切限制酶Sau3AⅠ酶（8U/μl）對基因組DNA進行酶切，研究發(fā)現(xiàn)倍比稀釋內(nèi)切酶的方法比較容易尋找到最佳酶量，結(jié)果表明在第1管中加入1μl Sau3AⅠ酶進行倍比稀釋后，37℃酶切30min，基因組DNA大量富集

4、在1～6kb范圍內(nèi)，可滿足切割2～4kbDNA片段的要求。計算得最佳酶切濃度為0.243U/μg、0.121U/μg、0.061 U/μg，按照這三個最佳濃度放大酶切體系，進行大量酶切反應，回收濃度和效率有較大的提高。
　　 用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收2～4kb的DNA片段，具有方便、快捷、穩(wěn)定的特點，不需要酚抽提和乙醇沉淀，回收率在60％左右。
　　 取100μl的轉(zhuǎn)化液涂布于LBS平板上，37℃培養(yǎng)1

5、8h后觀察計數(shù)，白色菌落數(shù)量在70％-80％以上，轉(zhuǎn)化效率達106 cfu/μg。采用高效感受態(tài)細胞DH5a常規(guī)轉(zhuǎn)化，得到了近15000個轉(zhuǎn)化子，遠遠超過了建庫理論上需要的轉(zhuǎn)化子。
　　 參照文獻中已經(jīng)報道的用于擴增毒死蜱降解菌YC-1 mpd基因的引物，以D3菌基因組DNA為模板進行PCR反應。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，可以見到約為1kp的特異性電泳條帶，與預計的大小相符，初步證明已成功的擴增出所需要的基因片段，將其回收克隆。PC