單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus）vasa基因及β-actin基因的克隆與表達分析.pdf

1、vasa基因編碼DEAD-box家族成員中一種ATP依賴的RNA解旋酶，在果蠅中作為生殖質的組成成份被首次報道。vasa基因可在許多后生動物生殖系細胞中特異性的表達，因此被廣泛用作生殖細胞的分子標記物，在動物生殖細胞發(fā)生和生殖調控等研究中起到了重要的作用。單環(huán)刺蜢(Urechis unicinctus)屬蜢蟲動物門(Echiuroidea)，是我國黃渤海沿岸常見的刺蜢物種。本文采用同源克隆策略及SMART-RACE技術，篩選和克隆了單環(huán)

2、刺<蟲益>vasa基因的全長cDNA序列，并利用半定量RT-PCR技術對其組織分布及發(fā)育過程的表達變化進行了分析，以期為進一步研究單環(huán)刺<蟲益>原生殖細胞的起源、分化及其生殖調控奠定基礎。 本研究獲得的單環(huán)刺<蟲益>vasa基因的cDNA序列全長4080bp，其中開放閱讀框ORF長2322bp，可以編碼773個氨基酸的蛋白，5′UTR(Untranslated Reagion，非編碼區(qū))為322bp，3′UTR為1436bp。B

3、lastp分析表明由該cDNA推導的氨基酸序列與哺乳動物、魚、兩棲類、昆蟲以及一些無脊椎動物的VASA蛋白序列均具有較高的相似性；除具有DEAD-box家族蛋白共有的全部8個保守motif曉外，在其N端還具有RGG重復序列及甘氨酸富集區(qū)等vasa亞家族基因的專一性特征結構；進一步的系統(tǒng)進化分析結果也顯示由該cDNA推導的蛋白序列和其他物種的VASA相關蛋白聚成一支，其與VASA亞家族成員的進化關系明顯近于PL10或是P68等其他DEAD

4、-box亞家族蛋白，表明獲得的為單環(huán)刺蜢的vasa基因的全長cDNA序列，并將其編碼的蛋白命名為UuVASA。采用半定量RT-PCR技術研究了單環(huán)刺蜢vasa mRNA在不同組織中的分布，發(fā)現(xiàn)在兩性生殖細胞中vasa基因均存在較高水平的表達，但在其他組織(非生殖期成體的體壁、中腸、呼吸腸、腎管及體腔液細胞)中則幾乎檢測不到其表達信號，表明在單環(huán)刺蜢體內，vasa基因同樣僅限制在生殖系細胞中表達，因此可以作為一個分子標記來追蹤單環(huán)刺<蟲益

5、>PGCs的起源、遷移和分化；對其各個發(fā)育階段表達的RT-PCR結果顯示，在卵母細胞及受精卵中均存在vasa mRNA的表達信號，因此認為單環(huán)刺（蟲益）（打不出來）早期胚胎中vasa基因的表達是由母源性提供的；從受精卵至8-細胞期其表達呈明顯增強趨勢，表明受精后啟動了vasa的合子表達；囊胚期的表達有所減弱，到擔輪幼蟲期其表達量極其微弱，之后又逐漸增強，表明擔輪幼蟲之后vasa基因主要由合子表達提供，其表達趨勢與其他大多數(shù)物種的vas

6、a基因相類似。此外，選擇性拼接的實驗結果中并未發(fā)現(xiàn)預期的拼接突變的條帶，因而初步推測單環(huán)刺（蟲益）（打不出來）vasa基因不存在N末端選擇性拼接的情況。β-actin因其高度保守的特征及持續(xù)衡量表達的特點，常作為許多量化實驗的內參照，并且其氨基酸序列被廣泛用于構建真核生物分子發(fā)生樹以反映物種間的進化關系。本研究中獲得的單環(huán)刺（蟲益）（打不出來）β-actin基因的eDNA序列全長1527bp，其中開放閱讀框ORF長1131bp，可編碼3

7、76個氨基酸；5＇UTR為82bp，3＇UTR為314bp。Blastp分析顯示由該cDNA推導的蛋白質與哺乳動物、兩棲類、魚、昆蟲以及貽貝、海星等無脊椎動物的I~-acfin蛋白序列存在很高的相似性，相似度均在95％以上，表明其在生物進化過程中保持著高度的保守性；進一步的系統(tǒng)進化分析也發(fā)現(xiàn)，單環(huán)刺（蟲益）（打不出來）β-actin與所有選擇物種的β-actin聚類，表明獲得的為單環(huán)刺（蟲益）（打不出來）β-actin基因的全長eDNA