牙鲆vasa基因的克隆、表達分析及其啟動子調控的GFP報告載體構建.pdf

1、原始生殖細胞（Primordial germ cells，PGCs）是有性生殖動物生殖細胞的祖細胞，在早期胚胎中形成后遷移到性腺原基，并最終產生卵和精子。Vasa屬于ATP依賴的RNA解旋酶中DEAD-box家族。自發(fā)現(xiàn)以來，vasa被認為是生殖細胞最可信的分子標記之一，在生殖系的起源、發(fā)育以及配子形成過程中發(fā)揮重要作用。牙鲆（Paralichthys olivaceus）是我國最重要的海水經濟魚類之一，對其生殖發(fā)育以及優(yōu)良種質資源保存

2、的研究具有重要意義。本文克隆了牙鲆Po-vasa的全長序列，并進行了序列特征分析和表達分析。通過染色體步移技術獲得Po-vasa啟動子序列，并構建了啟動子調控的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）報告載體pvasa-EGFP，為將來追蹤和分離牙鲆PGCs奠定基礎。
　　牙鲆Po-vasa cDNA全長2461 bp，其中ORF1941 bp，編碼646個氨基酸。5?UTR為175 bp，3?U

3、TR為345 bp。預測的氨基酸序列具有 DEAD-box家族蛋白所共有的9個保守結構域以及普遍存在于許多物種 Vasa蛋白 N末端的RG和RGG重復序列。結合染色體步移技術，最終得到牙鲆基因組中11443bp的片段。該片段包括了6927 bp的牙鲆vasa基因全長，3333 bp的5?側翼區(qū)和1183 bp的3?側翼區(qū)。Po-vasa基因全長共23個外顯子和22個內含子，起始密碼子位于外顯子II中。
　　熒光定量PCR分析顯示，

4、在十種不同組織中Po-vasa的表達僅限于性腺，其中卵巢內的表達水平顯著高于精巢內的表達水平；胚胎發(fā)育早期 Po-vasa為母源性表達，原腸胚期之前表達量高且較穩(wěn)定，在原腸期表達量驟降，低水平表達持續(xù)到孵化后1天。
　　通過對Po-vasa的PCR擴增及測序，發(fā)現(xiàn)存在10種選擇性剪接產生的不同的5?部分序列，而3?部分未見差異。因此推測牙鲆vasa基因至少存在10種選擇性剪接異構體，編號 A~J。A為本實驗最初克隆到的也是最主要的

5、一種轉錄本。異構體J由于缺失了8個堿基導致了移碼突變，其他異構體則均包含DEAD家族的9個保守結構域。對異構體B~J進行相對定量分析結果表明，不同異構體在性腺中的表達量不同，F(xiàn)表達量最高；同種異構體在精巢和卵巢的表達量也存在差異，如E和F。這些異構體在早期胚胎發(fā)育時期的表達模式也不盡相同。因此，不同異構體可能行使著不同的功能。
　　利用多種在線分析軟件對 Po-vasa3.3kb的啟動子區(qū)域進行生物信息學預測分析。在轉錄起始點TS

6、S上游31 bp處有1個典型的TATA box。啟動子區(qū)存在GATA-1、C/EBP、AP-1、SP-1、Oct-1、MZF1、c-Myc、SRY、Sox-5、AML-1a、HNF-3B等多個轉錄因子結合位點及多個糖皮質激素受體GR的結合位點，推測其可能對Po-vasa的調控起到關鍵作用。
　　PCR擴增Po-vasa的5和3調控序列，與增強型綠色色熒光蛋白（EGFP）基因連入載體，構建牙鲆Po-vasa啟動子調控的GFP報告載體