擬穴青蟹β-Actin基因與TGF-β受體基因的cDNA克隆及表達(dá)分析.pdf

1、擬穴青蟹(Scylla paramamosain),隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、、短尾亞目(Brachyura)、梭子蟹科(Portunidae),是我國(guó)沿海重要的海洋經(jīng)濟(jì)蟹類,具有重要的商品價(jià)值。近些年,隨著擬穴青蟹的養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大,很多國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者對(duì)于如何獲得生長(zhǎng)快速、經(jīng)濟(jì)性狀好的優(yōu)良擬穴青蟹品種而進(jìn)行了大量研究。本實(shí)驗(yàn)室正在開展擬穴青蟹轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序工作

2、,在測(cè)序過程中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)參與生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的生長(zhǎng)候選基因:β-Actin基因和TGF-βR基因。本研究克隆了這兩個(gè)基因,并研究了其表達(dá)調(diào)控及作用機(jī)理,為進(jìn)一步開展擬穴青蟹生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因分子調(diào)控機(jī)理的研究提供基礎(chǔ)資料。
　　1.β-Actin具有高度保守性、表達(dá)的持續(xù)穩(wěn)定性以及轉(zhuǎn)錄的大量、高效性特點(diǎn),這些特點(diǎn)使得β-Actin基因常作為內(nèi)標(biāo)基因使用,并利用β-Actin的氨基酸序列構(gòu)建分子進(jìn)化樹,分析物種間的進(jìn)化關(guān)系。然而近年來研究

3、發(fā)現(xiàn),β-Actin基因有時(shí)也會(huì)受到不同生理狀態(tài)或者環(huán)境的調(diào)控而出現(xiàn)表達(dá)水平的差異。因此,在采用β-Actin基因作為分子內(nèi)標(biāo)開展實(shí)驗(yàn)研究時(shí),必須首先評(píng)價(jià)其在該物種中的表達(dá)特征。本研究針對(duì)β-Actin基因能否作為內(nèi)參基因進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)評(píng)估,并分析了擬穴青蟹與其他物種間的進(jìn)化關(guān)系。
　　研究采用RT-PCR和RACE技術(shù),從擬穴青蟹肌肉組織中鑒定出β-actin基因的cDNA全序列。序列分析結(jié)果表明:擬穴青蟹β-actin基因全長(zhǎng)14

4、34 bp,包括完整的開放閱讀框1131 bp、5’端非翻譯區(qū)60 bp及3’端非翻譯區(qū)243 bp。該基因編碼376個(gè)氨基酸,蛋白分子量為41.79 KDa,等電點(diǎn)為5.205。同源性比較表明,該基因與其它物種具有高度的氨基酸保守性。聚類分析表明,擬穴青蟹與百慕大陸蟹的親緣關(guān)系最近。熒光定量PCR分析表明,β-Actin基因在擬穴青蟹血液、心臟、肝胰腺、胃、鰓、肌肉、精巢、結(jié)締組織中均有表達(dá),在肌肉組織中的表達(dá)量最高,在胃、精巢、血液

5、、肝胰腺、心臟、鰓組織中的表達(dá)量依次降低,在結(jié)締組織中的表達(dá)量最低;β-Actin基因在仔蟹3期、蛻殼前期、脫殼后期三個(gè)時(shí)期的均具表達(dá),但是表達(dá)量逐漸增加,具有明顯的差異性;由于該基因在擬穴青蟹不同組織、不同時(shí)期的表達(dá)量存在明顯的差異,因此不適用于作為內(nèi)參基因使用。
　　2. TGF-βR基因是啟動(dòng)TGF-β超家族成員發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的重要受體因子。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中需要I型和 II型兩類受體基因的參與,這些受體均為具有激酶活性的跨

6、膜受體,胞內(nèi)區(qū)和胞外區(qū)默契配合共同發(fā)揮作用。TGF-β超家族成員首先與細(xì)胞膜表面的II型和 I型受體結(jié)合,啟動(dòng)其信號(hào)傳導(dǎo),進(jìn)而激活下游 S mad蛋白,將信號(hào)傳遞至細(xì)胞核內(nèi),調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。本研究采用克隆技術(shù)對(duì)擬穴青蟹中 TGF-β/Smad信號(hào)通路中TGF-βR基因進(jìn)行了cDNA和 DNA克隆,并運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析了該基因核苷酸和氨基酸序列特征;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)TGF-β受體基因進(jìn)行了組織表達(dá)分析,為擬穴青蟹中TGF

7、-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)和相關(guān)基因功能的研究,及生長(zhǎng)性狀相關(guān)標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用提供了參考。主要結(jié)果如下:
　　在擬穴青蟹中,首次克隆得到了TGF-βR基因的cDNA全長(zhǎng)序列為2035 bp,包括完整開放閱讀框1164 bp,5’端非翻譯區(qū)607 bp,3’端非翻譯區(qū)264 bp。3’ UTR包含有16 bp的poly(A)尾,在poly(A)上游27 bp處可見保守的加尾信號(hào)序列AAATAA。預(yù)測(cè)該基因的二級(jí)結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)該基因具有膜外區(qū)

8、、胞內(nèi)區(qū)以及跨膜區(qū)等TGF-β超家族絲氨酸/蘇氨酸激酶受體特有的結(jié)構(gòu)特征,且該基因具有明顯22個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽序列。序列比對(duì)分析顯示:該基因在GS區(qū)域高度保守,且與其他物種的I型受體同源性較高。根據(jù)TGF-βR基因的氨基酸構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹,明顯的分為三支,該基因聚類與I型受體。檢測(cè)該基因在擬穴青蟹8個(gè)組織的表達(dá)水平,該基因在所有組織中具有表達(dá),在性腺和肌肉組織中的表達(dá)量最高,推測(cè)該基因參與青蟹肌肉的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和生殖發(fā)育過程。