單環(huán)刺螠血紅蛋白F-I全長(zhǎng)cDNA序列克隆、原核表達(dá)及抗菌活性研究.pdf

1、血紅蛋白(Hemoglobin,Hb)是一種具有運(yùn)載氧、阿片肽、免疫調(diào)節(jié)、抗菌和鎮(zhèn)痛等功能的蛋白。本課題研究表明Hb片段(hemocidins)是機(jī)體在先天性免疫中殺死外源微生物的重要因子。
　　單環(huán)刺螠(Urechis unicinctus,Uu)隸屬于螠蟲(chóng)動(dòng)物門(mén),是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的無(wú)脊椎動(dòng)物。其長(zhǎng)期生活在海邊潮間帶泥性底質(zhì)中,為濾食性動(dòng)物,直接暴露于各種病原菌及寄生蟲(chóng)等,但其非特異性免疫系統(tǒng)成功地抵御外來(lái)入侵,其中Hb可能起

2、重要作用,而目前對(duì)Uu Hb的研究沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。
　　本課題根據(jù)Uu同屬物種美洲刺螠(Urechis caupo,Uc)Hb F-I完整的cDNA序列(GI:945055),通過(guò)3’RACE和5’RACE克隆了Uu Hb F-I的全長(zhǎng)cDNA,共780bp。開(kāi)放閱讀框含429bp,翻譯為含142個(gè)氨基酸殘基的成熟肽,命名為UuHb-F-I。預(yù)測(cè)分子量為15120.67Da,等電點(diǎn)為9.02,其二級(jí)結(jié)構(gòu)中含大量α螺旋。
　　為

3、獲得UuHb-F-I,構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3)/pET-22b-UuHb-F-I,經(jīng)IPTG和乳糖誘導(dǎo)表達(dá)成功,其中乳糖誘導(dǎo)在37℃、180r/min誘導(dǎo)16h時(shí),重組蛋白可達(dá)最大表達(dá)量,且雜蛋白較少。大量誘導(dǎo)表達(dá)后,尿素溶解包涵體,使用鎳柱親和層析純化重組蛋白,洗脫的目的蛋白含雜蛋白少。通過(guò)多次透析逐漸除去尿素及其它鹽離子,最后冷凍干燥得重組蛋白固體。
　　采用液相分析法(liquid phase assay)對(duì)重組蛋