四川盆地蘇云金芽胞桿菌cry和cyt基因的鑒定及其新型模式cry基因研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis，簡稱Bt)是目前世界上應(yīng)用范圍最廣的生防微生物，它在農(nóng)作物、園藝植物、森林以及衛(wèi)生害蟲的防治方面得到廣泛的應(yīng)用。由于Bt殺蟲基因的巨大應(yīng)用價(jià)值，世界許多國家都將Bt新資源的收集、鑒定與開發(fā)作為重點(diǎn)，開展了大規(guī)模資源采集、分析的基礎(chǔ)性工作。深入發(fā)掘我國豐富的Bt菌株和基因資源，篩選高毒力及特異性菌株，分離克隆新型殺蟲基因，其結(jié)果不但可以為生產(chǎn)高效的Bt菌制劑和生產(chǎn)菌株的輪換提供后

2、備菌株，也可以為構(gòu)建高效廣譜工程微生物和培育轉(zhuǎn)基因抗蟲植物帶來基因資源。本研究立足具有獨(dú)特生態(tài)環(huán)境和豐富生物多樣性的四川盆地，對其Bt資源進(jìn)行更為系統(tǒng)的調(diào)查研究，結(jié)果如下：
　　 1.采集四川盆地具有代表性的生態(tài)區(qū)土壤樣品3834份，利用醋酸鈉-抗生素法分離Bt菌1172株，平均分離率為13.9％。菌株的伴胞晶體有長（短）菱形、大（?。┝庑?、方形、球形和不定形等7種形狀，充分顯示了四川盆地Bt資源的多樣性。采用PCR-RFLP鑒

3、定方法對1172株菌株進(jìn)行了cry和cyt基因的鑒定分析，共發(fā)現(xiàn)了cry1、cry2、cry3、cry9、cry8、cry4/10、cry30、cry40和cyt2等9種基因型；cry1和cry2型基因最豐富，分別占64％和39.4％；cry3、cry4/10、cry9、cry30和cyt2型含量較少；cry8和cry40類基因含量最少。對未鑒定出基因型的Bt菌株殺蟲晶體蛋白進(jìn)行了SDS-PAGE分析，結(jié)果表明這些菌株殺蟲晶體蛋白類型存

4、在多樣性，可以推測這些菌株極有可能含不同的基因及基因組合。在PCR-RFLP鑒定過程中，發(fā)現(xiàn)菌株JF19-2、BtMc28、Hs18-1、Ywc2-8和Bm59-2含有新型模式cry基因。另外，本研究對部分Bt菌株進(jìn)行了殺蟲活性的測定，發(fā)現(xiàn)它們具有較寬的殺蟲譜，對鱗翅目及雙翅目害蟲具有很好的殺蟲活性。以上結(jié)果表明：四川生態(tài)區(qū)蘊(yùn)藏著豐富而特別的Bt資源，為害蟲的防治提供了基因及菌株資源。
　　 2.與Cry1類蛋白相比，Cry2A

5、和Cyt類蛋白具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和致病機(jī)制；另外，Cry2A和Cyt分別兼具較廣的殺蟲譜和對Cry類蛋白的協(xié)同作用等特性。因此本節(jié)首先對含cry2類基因的菌株的殺蟲晶體蛋白進(jìn)行分析，同時(shí)在鑒定四川盆地cry2和cyt2類基因基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步對其基因的分布、基因的分型、以及新型基因的克隆和表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果表明：1）含cry2型基因的462個菌株主要分布在農(nóng)田和森林之中，它們產(chǎn)生不規(guī)則形、棱形、方形和球狀等4種伴胞晶體；通過SDS-PAGE分

6、析可以看出，這些菌株主要表達(dá)4種不同的蛋白質(zhì)，分子量為60-130kDa之間；這些結(jié)果充分說明了四川盆地此類Bt菌株伴胞晶體蛋白具有多樣性。2）PCR-RFLP分析表明，四川盆地含有3種不同的cry2基因類型：cry2Aa、cry2Ab和一個新型的cry2A類型（JF19-2菌株之中）；3）本地區(qū)僅在森林土壤之中發(fā)現(xiàn)11個含cyt2類基因的Bt菌，通過PCR-RFLP鑒定表明，這些基因?qū)儆赾yt2Aa基因類型；4）以JF19-2及BtM

7、c28（含cyt2Aa基因）為出發(fā)菌，采用Tail-PCR和PCR技術(shù)分別獲得新型的cry2A類和cyt2Aa基因的全長序列，并被國際Bt殺蟲晶體蛋白基因命名委員會正式命名為cry2Ag1和cyt2Aa3基因；5）cry2Ag1和cyt2Aa3基因在大腸桿菌中得到了表達(dá)，其中cry2Ag1基因表達(dá)產(chǎn)物對小菜蛾，棉鈴蟲及伊蚊都具有較好的殺蟲活性，因此Cry2Ag1蛋白可以做為一個輪換或替代蛋白應(yīng)用于雙翅目、鱗翅目害蟲的控制以及在轉(zhuǎn)基因植物

8、等領(lǐng)域；而cyt2Aa3的基因表達(dá)產(chǎn)物僅對伊蚊具有殺蟲活性。本節(jié)研究明確了四川盆地cry2和cyt2類基因的分布、類型，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了兩個最有較好殺蟲活性的殺蟲晶蛋白，其研究成果在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重要意義和應(yīng)用前景。
　　 3.含有新型的殺蟲基因的BtMc28、Bm59-2、Hs18-1和Ywc2-8分別來自沐川原始森林、碧峰峽自然保護(hù)區(qū)、海螺溝冰川原始森林。本節(jié)對這4株Bt菌進(jìn)行了生物學(xué)特性鑒定、新型模式基因克隆與表達(dá)研究。1）通過

9、掃描電鏡觀察，這些菌株均產(chǎn)生球狀晶體；2）SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，BtMc28主要表達(dá)3種分子量約為130、70和28kDa的蛋白質(zhì)，Ywc2-8與Hs18-1菌株均主要表達(dá)分子量為130和70kDa的2種蛋白質(zhì)，而Bm59-2只產(chǎn)生一種約70kDa的蛋白質(zhì)；3）這4個菌株的質(zhì)粒圖譜在帶型和大小上都存在很大差異（Hs18-1與Ywc2-8除外），這們的質(zhì)粒圖譜都與對照菌不一樣；4）這4個菌株的鞭毛生長情況、生理生化特性和碳源利用，

10、同所報(bào)道的Bt菌類似；H血清型鑒定結(jié)果顯示，BtMc28、HS18-1和Ywc2-8菌株為新的血清型亞種，命名為：Btserovarsichuansis，Btserovarmuchuansis，Btserovaryaansis；Bm59-2屬于血清型為H22的B.thuringiensisserovarshandongiensis亞種。5）運(yùn)用SON-PCR、Tail-PCR以及PCR技術(shù)分別從BtMc28、Hs18-1、Ywc2-8和

11、Bm59-2中克隆了11個新型基因（其中8個為新型模式基因），并獲正式命名；這幾個菌株在殺蟲基因組成上存在差異（BtMc28含cry54Aa1、cry53Ab1、cry30Fa1、cry4Cc1、cyt2Aa3；Hs18-1含cry54Ba類，cry30Ga1、cry4Cb1；Ywc2-8含cry56Aa1、cry4Cb2、cry30Ea2；Bm59-2含cry52Ba1)；6)cry56Aa1、cry54Aa、cry52Ba1、cry

12、30Fa1、cry30Ga1和cry4Cb1基因在大腸桿菌中得到了表達(dá)；生測結(jié)果表明，Cry56Aa1、Cry54Aa1、Cry52Ba1、Cry30Fa1和Cry30Ga1具有較寬的殺蟲譜，它們對鱗翅目及雙翅目害蟲具有殺蟲活性，其中Cry56Aa1的殺蟲譜最寬，它對小菜蛾、棉鈴蟲和伊蚊都具很好的活性。綜上所述，通過對這4個菌株的生物學(xué)特性、殺蟲蛋白基因的分析和表達(dá)研究，其研究結(jié)果可以為進(jìn)一步利用這幾株菌，提供一定技術(shù)支持和理論依據(jù)：新