蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白Cry1Ie定向進(jìn)化的研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthuringiensis，Bt）是目前世界上應(yīng)用范圍最廣的殺蟲微生物，其殺蟲活性主要來源于殺蟲基因編碼的晶體蛋白。但是，Cry蛋白殺蟲譜窄、毒力有限，以及害蟲對Bt毒素的抗性風(fēng)險上升等諸多弱點和因素將嚴(yán)重制約Bt在未來農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中進(jìn)一步發(fā)揮巨大作用。但是，繼續(xù)從自然界中分離克隆得到對害蟲具有高毒力的新型Btcry基因難度不斷增加。因此，通過分子設(shè)計、蛋白質(zhì)工程等新的技術(shù)對現(xiàn)有的Cry毒素進(jìn)行改造、使之發(fā)揮

2、更大的作用是不少研發(fā)單位的新的研究目標(biāo)。
　　 本論文圍繞建立一種可控突變率的隨機(jī)突變文庫的方法、蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白Crylle的定向進(jìn)化等方面進(jìn)行了一系列的研究，主要結(jié)果如下：
　　 1、將crylAc基因啟動子與crylIe基因通過重疊引物PCR的方法連接在一起，構(gòu)建crylIe基因在E.coliJM109中的表達(dá)載體。
　　 2、在建立隨機(jī)突變文庫的過程中，依據(jù)TaqDNA聚合酶在合成堿基時的固有誤

3、差和突變特性，結(jié)合Cry毒素定向進(jìn)化過程中需要的堿基突變數(shù)目，計算得到產(chǎn)生預(yù)期堿基突變所需PCR循環(huán)數(shù)。同時，本研究采用了熒光定量PCR監(jiān)測PCR過程中DNA擴(kuò)增來控制TzqDNA聚合酶的聚合反應(yīng)的次數(shù)。
　　 3、以對小菜蛾（Plutellaxylostella）、亞洲玉米螟（Ostriniafurnacalis）有殺蟲活性的crylIe基因為材料，建立3個不同堿基替換率的隨機(jī)突變文庫，文庫Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中的每個DNA分子的預(yù)期堿

4、基替換個數(shù)分別為1個、2個和3個。從3個文庫中分別隨機(jī)挑取100個克隆進(jìn)行序列測定分析，結(jié)果表明，突變的堿基位點在crylIe基因中隨機(jī)均勻分布；文庫Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ突變的單克隆數(shù)分別為59個、93個和98個；無義突變的克隆數(shù)分別為36個、43個、50個，錯義突變的克隆數(shù)分別為13個、41個、38個；平均堿基替換個數(shù)為0.86個、2.1個、2.79個。綜合以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究設(shè)計的方法可以很好控制突變文庫的堿基突變率，預(yù)期突變2個堿基的文庫最

5、適合用作Cry毒素的定向進(jìn)化。
　　 4、建立隨機(jī)突變文庫之后，進(jìn)一步用小菜蛾進(jìn)行生物活性的測定。測試了92個錯義突變的突變株，結(jié)果表明與未突變的CrylIe（LC50為1.96μg/ml）相比活性升高的有11株，其LC50分別是0.20、0.82、0.15、0.44、0.62、0.50、0.29、0.51、0.58、0.30、0.67μg/ml，氨基酸的變化分別是Y162H&E181K、N214S、V236A、K237R、Y2

6、39H&A307V、N258Y、1285T&R506G、P320H&Y599N、Y422H、1507V、A522V，這些突變位點分別分布在CrylIe的三個結(jié)構(gòu)域中，其中活性提高最明顯是13倍，位于結(jié)構(gòu)域Ⅱ中的雙突變體Y239H&A307V。
　　 本研究建立了一種簡單的可控突變率的隨機(jī)突變文庫的方法；在此基礎(chǔ)上，篩選獲得了多個毒力提高的突變，結(jié)果說明本文所建立的定向進(jìn)化方法適合于其它Cry，毒素，研究所獲得的各種突變體，將為抗