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文檔簡介
1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis,簡稱Bt)是一種分布廣泛的革蘭陽性細菌,伴隨芽胞形成產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白(Insecticidalcrystalproteins,簡稱ICPs),能夠毒殺包括鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等九個目的500多種昆蟲,被廣泛應用于害蟲防治。棉鈴蟲是世界性重要農(nóng)業(yè)害蟲,隨著Bt殺蟲劑的廣泛使用和轉(zhuǎn)基因棉花的廣泛種植,棉鈴蟲的抗性問題已經(jīng)成為制約生物Bt農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸,更深入地了解Bt對鱗翅目
2、昆蟲的作用機理,對于研究Bt合理使用、制定延緩昆蟲抗性發(fā)展的策略具有重要意義。 本研究以BtHTX—42(Cry1Ac)為研究菌株,利用液體雙相分離法初步提取毒素晶體蛋白,采用等電點沉淀法進行純化,然后將所得毒素蛋白溶解,最后經(jīng)凝膠過濾層析,收集280nm紫外吸收峰蛋白樣品,SDS—PAGE分析得到高純度、高濃度的BtCry1Ac毒素。 本研究以四齡棉鈴蟲幼蟲為供試昆蟲,通過差速離心法,成功分離到棉鈴蟲幼蟲中腸刷狀緣膜囊
3、(BBMV),采用Bradford法分別對其提取后的組織碎片、離心上清液、離心沉淀中的蛋白含量進行測定,發(fā)現(xiàn)大部分蛋白質(zhì)都存在于提取的中腸BBMV離心沉淀中。 利用生物素標記BtCry1Ac毒素活化片段,進行體外競爭結合印跡分析,在大約60kDa處明顯有一條單一的蛋白條帶,增加未經(jīng)生物素標記的Cry1Ac毒素含量,蛋白條帶呈現(xiàn)減弱趨勢,毒素與BBMV的結合相對量也不斷降低,當未經(jīng)生物素標記的Cry1Ac毒素含量增加為初始濃度的1
4、00倍時,毒素與BBMV的結合相對量由開始的100%下降為20%,相對降低了約80%。表明Cry1Ac毒素相互之間能夠發(fā)生同源競爭結合,制備的Cry1Ac毒素和棉鈴蟲中腸BBMV能夠用于后續(xù)試驗,具有較高的生理活性。 采用SDS—PAGE和免疫共沉淀技術研究表明,Cry1Ac毒素對棉鈴蟲中腸BBMV總蛋白量和棉鈴蟲中腸受體蛋白都產(chǎn)生明顯影響。與未飼喂毒素棉鈴蟲相比較,毒素作用后的棉鈴蟲中腸小分子量蛋白條帶出現(xiàn)丟失,尤其是在蛋白表
5、達量上表現(xiàn)出較大差異,特別是成功分離到一種120kDa的蛋白,經(jīng)過質(zhì)譜分析鑒定為氨肽酶APN,并且中腸受體蛋白氨肽酶APN表達量也明顯增加。 采用Westernblot技術研究Cry1Ac毒素寡聚體形成能力,結果表明Cry1Ac毒素在棉鈴蟲中腸BBMV中能夠形成二聚體和四聚體,經(jīng)過100℃高溫處理后毒素寡聚體完全解離為毒素單體。 研究Cry1Ac毒素作用前后對棉鈴蟲幼蟲病理學的影響發(fā)現(xiàn),與正常棉鈴蟲幼蟲相比,飼喂毒素的棉
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