基于果蠅RNA干擾系研究運(yùn)動(dòng)抗衰老候選基因Trpa1的功能.pdf

1、1.研究目的
　　 構(gòu)建果蠅Hand>TrpalRNAi系，從生命周期、運(yùn)動(dòng)能力及心臟功能三個(gè)方面評(píng)價(jià)候選基因Trpal在運(yùn)動(dòng)抗衰老中的功能效應(yīng)，探究果蠅抗衰老分子機(jī)制研究模式，為大批量篩選果蠅抗衰老候選基因提供前期基礎(chǔ)。
　　 2.研究方法
　　 Hand>TrpalRNAi系構(gòu)建：取8小時(shí)內(nèi)羽化Hand-Gal4品系(湖南師范大學(xué)心臟發(fā)育研究中心提供)雄性果蠅與UAS-TrpalRNAi品系(購于美國伯明翰品

2、系中心)處女蠅雜交，F(xiàn)1代為Trpal基因RNAi系，挑取12小時(shí)內(nèi)羽化F1代雄性果蠅2400只，隨機(jī)分為Hand>TrpalRNAi安靜組，Hand>TrpalRNAi平板運(yùn)動(dòng)組。另挑選2400只12小時(shí)內(nèi)羽化UAS-TrpalRNAi基因果蠅，實(shí)驗(yàn)分組為UAS-TrpalRNAi安靜組及UAS-TrpalRNAi運(yùn)動(dòng)組。每組各1200只。(飼養(yǎng)條件為：25℃恒溫，50％濕度，12/12小時(shí)晝夜循環(huán)光照)。
　　 采用果蠅運(yùn)動(dòng)

3、訓(xùn)練平臺(tái)，8天齡執(zhí)行規(guī)律性平臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，設(shè)定：電機(jī)轉(zhuǎn)速為24s/r，平臺(tái)起降高度值9.5cm。應(yīng)用視頻檢測(cè)系統(tǒng)監(jiān)控訓(xùn)練強(qiáng)度。前兩天為適應(yīng)性訓(xùn)練，6天齡適應(yīng)性訓(xùn)練20分鐘，7天齡為45分鐘，8天齡開始正是進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)間為2.5小時(shí)，訓(xùn)練頻率為隔天訓(xùn)練一次，直至方案結(jié)束。
　　 運(yùn)動(dòng)方案執(zhí)行結(jié)束后12h內(nèi)隨機(jī)挑取各組別果蠅分別進(jìn)行生命存活指數(shù)、運(yùn)動(dòng)攀爬能力、心臟功能檢測(cè)。生命存活指數(shù)的測(cè)定從運(yùn)動(dòng)方案結(jié)束后隔天開始，取各組別果

4、蠅100只，相同環(huán)境飼養(yǎng)，隔天更換一次培養(yǎng)基(更換的培養(yǎng)基為相同配方同批次制備)，每天記錄各組別果蠅死亡數(shù)，制作果蠅存活曲線。運(yùn)動(dòng)攀爬能力檢測(cè)從運(yùn)動(dòng)結(jié)束后24小時(shí)開始，每組隨機(jī)挑選果蠅100只，以每管20只為標(biāo)準(zhǔn)，試管規(guī)格為標(biāo)準(zhǔn)高×徑=20cm×2cm，從棉塞至底部預(yù)留18cm作為攀爬區(qū)域，以標(biāo)尺從底部劃分試管為1、2、3、4、5、6、7、8、9共九區(qū)域，每區(qū)域?yàn)楦摺翉?2cm×2cm，各區(qū)域的得分為相應(yīng)的1、2、3、4、5、6、7、8

5、、9分，通過視頻檢測(cè)系統(tǒng)計(jì)數(shù)規(guī)定時(shí)間內(nèi)各區(qū)域的果蠅數(shù)，該區(qū)域的果蠅數(shù)與區(qū)域得分之和即為該區(qū)域總得分，計(jì)算各區(qū)域總得分之和即為果蠅攀爬指數(shù)。取各組別14天齡果蠅、28天齡果蠅、42天齡果蠅各100只連續(xù)進(jìn)行心臟功能檢測(cè)。方法為：脈沖電激儀PHIPPS&BIRD，設(shè)定值為40V，6Hz，30s刺激，兩分鐘內(nèi)看心管恢復(fù)情況(正常、纖維性顫動(dòng)、停止)。分別計(jì)數(shù)，纖維性顫動(dòng)和停止的果蠅與總數(shù)的百分比即為心臟衰竭率。
　　 3.研究結(jié)果

6、r>　　 3.1果蠅同源基因的查找結(jié)果
　　 通過BLASP的序列比對(duì)、SMART結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及近年相關(guān)文獻(xiàn)查閱，發(fā)現(xiàn)在果蠅物種中transientreceptorpotentialA1基因編碼蛋白無論是一級(jí)序列還是功能預(yù)測(cè)都和大鼠Trpal基因蛋白具有高度相似性，因此確定大鼠Trpal基因在果蠅物種中的同源基因?yàn)閠ransientreceptorpotentialA1。
　　 3.2果蠅生命周期的檢測(cè)結(jié)果
　　

7、(1)在果蠅半數(shù)死亡時(shí)間檢測(cè)中UAS-TrpalRNAi運(yùn)動(dòng)組果蠅半數(shù)死亡壽命值比UAS-TrpalRNAi對(duì)照組果蠅的壽命值高，且具有顯著性差異(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (2)在果蠅平均壽命的檢測(cè)中Hand>TrpalRNAi運(yùn)動(dòng)組果蠅平均壽命值比Hand>TrpalRNAi對(duì)照組果蠅壽命值低，且具有顯著性差異(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (3)在果蠅最高壽命的檢測(cè)中Hand>Trp

8、alRNAi對(duì)照組果蠅最高壽命值比UAS-TrpalRNAi空白對(duì)照組低，且具有顯著性差異(P<0.05)，Hand>TrpalRNAi運(yùn)動(dòng)組的最高壽命值比Hand>TrpalRNAi對(duì)照組低，且具有顯著性差異(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (4)UAS-TrpalRNAi運(yùn)動(dòng)組與空白對(duì)照組相比平均延壽率升高，Hand>TrpalRNAi對(duì)照組與空白對(duì)照組相比延壽率下降，而運(yùn)動(dòng)干預(yù)Hand>TrpalRNAi果蠅后

9、平均延壽率下降明顯。
　　 3.3果蠅攀爬能力的檢測(cè)結(jié)果
　　 隨年齡增長，果蠅攀爬能力出現(xiàn)明顯下降，其中UAS-TrpalRNAi運(yùn)動(dòng)組的攀爬能力在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練下明顯改善，說明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練延緩了果蠅攀爬能力的衰老。而Hand>TrpalRNAi后運(yùn)動(dòng)能力相比未干擾前明顯下降，且運(yùn)動(dòng)干預(yù)無助于這一攀爬能力的提升。
　　 3.4果蠅心臟形態(tài)觀察結(jié)果
　　 UAS-TrpalRNAi幼蟲心管與Hand>TrpalRN

10、Ai幼蟲心臟心管細(xì)胞排列均較規(guī)則，心臟發(fā)育正常。通過觀察5周年齡果蠅心管形態(tài)結(jié)構(gòu)，UAS-TrpalRNAi果蠅的心管與Hand>TrpalRNAi心管形態(tài)上排列上都較為緊密規(guī)則，心肌細(xì)胞和圍心細(xì)胞形態(tài)大小無明顯差異。
　　 3.5果蠅心率衰竭的檢測(cè)結(jié)果
　　 果蠅心臟衰竭率與果蠅年齡具有高度相關(guān)性，與空白對(duì)照組相比，UAS-TrpalRNAi平臺(tái)運(yùn)動(dòng)組果蠅抗心衰竭率有影響，Hand>TrpalRNAi后果蠅心率衰竭率增

11、加明顯，運(yùn)動(dòng)干預(yù)Trpal基因干擾品系會(huì)使這一衰竭更為明顯。
　　 4.結(jié)論
　　 4.1Trpal基因沉默可導(dǎo)致果蠅生命周期縮短。
　　 4.22.5小時(shí)規(guī)律平臺(tái)運(yùn)動(dòng)延緩UAS-TrpalRNAi品系果蠅攀爬能力衰退；沉默Trpal基因果蠅攀爬能力下降明顯，Trpal基因的表達(dá)抑制可導(dǎo)致果蠅運(yùn)動(dòng)能力下降。
　　 4.3Trpal基因表達(dá)缺陷不會(huì)導(dǎo)致心臟形態(tài)改變，但增加果蠅心衰竭率，說明Trpal基因表達(dá)