基于代謝組學(xué)的果蠅衰老過(guò)程性別差異及黃芩醇提物抗衰老活性研究.pdf

1、選題依據(jù)：衰老同時(shí)伴隨著多種慢性疾病的頻發(fā)，是人類生活所必將經(jīng)歷的階段。近年來(lái)，由于全球人口老齡化加劇，衰老人群數(shù)量逐年增多，人們對(duì)于延緩衰老，延長(zhǎng)健康壽命的渴望也越來(lái)越強(qiáng)烈。盡管人類科學(xué)技術(shù)水平飛速發(fā)展，至今也依然不能夠全面的闡釋衰老的內(nèi)在機(jī)制。代謝組學(xué)是依靠先進(jìn)的分析技術(shù)平臺(tái)，獲取機(jī)體內(nèi)源性小分子代謝物的信息，從機(jī)體代謝物的角度出發(fā)，分析闡釋機(jī)體內(nèi)已發(fā)生的一系列生物學(xué)事件，當(dāng)前對(duì)于代謝組學(xué)的研究已經(jīng)逐步的應(yīng)用到各種復(fù)雜疾病中，這對(duì)于

2、衰老研究同樣是一個(gè)契機(jī)。在我國(guó)，很早以前就發(fā)現(xiàn)了黃芩的藥用價(jià)值，并且目前我國(guó)黃芩現(xiàn)有的資源量比較大，應(yīng)用比較廣泛。當(dāng)前已有研究表明黃芩具有多種藥理活性其中就包括清除自由基、抗氧化以及神經(jīng)保護(hù)等，除此之外還有研究表明黃芩能夠改善機(jī)體多種抗氧化作用酶的活性，可能具有抗衰老的藥理作用。課題組前期采用D-半乳糖致大鼠衰老模型，結(jié)合代謝組學(xué)的研究方法評(píng)價(jià)黃芩抗衰老活性，在此研究基礎(chǔ)上，課題組引入果蠅自然衰老模型。果蠅具有壽命短、易飼養(yǎng)、成本低、實(shí)

3、驗(yàn)操作簡(jiǎn)單等多種優(yōu)勢(shì)，目前也是衰老研究中常用的一種模式生物，但以模式生物果蠅為研究對(duì)象結(jié)合代謝組學(xué)的研究方法進(jìn)行衰老以及衰老過(guò)程中性別差異的研究目前還不多見(jiàn)，以模式生物果蠅為研究對(duì)象結(jié)合代謝組學(xué)的研究方法對(duì)黃芩抗衰老活性進(jìn)行評(píng)價(jià)的研究目前還未見(jiàn)報(bào)道。
　　目的：以模式生物果蠅為研究對(duì)象結(jié)合代謝組學(xué)的研究方法對(duì)衰老以及衰老過(guò)程中的性別差異進(jìn)行探索；以果蠅自然衰老模型結(jié)合代謝組學(xué)的研究方法評(píng)價(jià)黃芩抗衰老的活性。
　　方法：

4、>　　1.將同一批次果蠅樣本在同一條件下分別飼養(yǎng)至生長(zhǎng)過(guò)程中的3d、15d、30d、45d四個(gè)生長(zhǎng)階段，并分別收集每個(gè)階段的果蠅組織樣本進(jìn)行1H-NMR代謝組學(xué)分析，進(jìn)而動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)果蠅代謝輪廓及內(nèi)源性代謝產(chǎn)物在其生長(zhǎng)過(guò)程中的3d、15d、30d、45d四個(gè)代表性的生長(zhǎng)階段的變化規(guī)律。首先，結(jié)合無(wú)監(jiān)督模式的主成分分析(PCA)以及有監(jiān)督模式的偏最小二乘判別分析(PLS-DA)對(duì)果蠅3d、15d、30d、45d四個(gè)生長(zhǎng)階段代謝輪廓變化規(guī)律進(jìn)行

5、分析。其次，分別以聚類熱點(diǎn)圖及折線圖兩種形式對(duì)果蠅組織部分代謝物在3d、15d、30d、45d四個(gè)代表性的生長(zhǎng)階段的變化情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算代謝物隨年齡變化的相關(guān)系數(shù)，分別篩選出雌雄果蠅隨年齡變化相關(guān)的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，再綜合雌雄果蠅兩種性別，取其共有的隨年齡變化相關(guān)的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物作為果蠅與衰老相關(guān)的代謝標(biāo)志物。最后，對(duì)所篩選出來(lái)的代謝物進(jìn)行代謝通路的富集，尋找與果蠅衰老相關(guān)的代謝通路。
　　2.以代謝組學(xué)的研究方法分別對(duì)果蠅生長(zhǎng)

6、過(guò)程中的3d、15d、30d、45d四個(gè)代表性的生長(zhǎng)階段，每個(gè)階段中雌雄果蠅之間代謝輪廓的差異進(jìn)行分析。首先，以PCA以及PLS-DA對(duì)雌雄果蠅代謝輪廓的差異進(jìn)行模式判別之后，結(jié)合正交-偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)以及“S-plot”分別尋找3d、15d、30d、45d四個(gè)代表性的生長(zhǎng)階段引起雌雄果蠅組間差異的代謝物。然后，綜合3d、15d、30d、45d四個(gè)代表性的生長(zhǎng)階段分析，篩選出雌雄果蠅之間在3d、15d、30d、45d

7、四個(gè)代表性的生長(zhǎng)階段一直存在且雌性含量始終高于（或低于）雄性含量的差異代謝物為與雌雄果蠅之間性別差異相關(guān)的代謝物，而那些既與性別差異相關(guān)又與衰老相關(guān)的代謝物即為與衰老過(guò)程性別差異相關(guān)的代謝標(biāo)志物。最后，對(duì)與衰老過(guò)程性別差異相關(guān)的代謝標(biāo)志物進(jìn)行代謝通路富集，尋找雌雄果蠅之間與衰老過(guò)程性別差異相關(guān)的代謝通路。
　　3.在初步了解果蠅衰老過(guò)程中代謝變化規(guī)律的前提下，以果蠅壽命研究及代謝組學(xué)研究方法分別對(duì)黃芩抗衰老活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。首先，以添

8、加有不同濃度黃芩提取物（包括0.1g/L、1g/L、5g/L三個(gè)濃度梯度）的給藥組培養(yǎng)基飼養(yǎng)果蠅，并以空白培養(yǎng)基飼養(yǎng)的正常供應(yīng)為相應(yīng)的對(duì)照，使其均在同樣的培養(yǎng)條件下進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)分析黃芩提取物對(duì)果蠅平均壽命及最高壽命的影響。然后以3d齡果蠅為正常對(duì)照組，以空白培養(yǎng)基培養(yǎng)的30d齡果蠅為衰老模型組，以黃芩給藥培養(yǎng)基培養(yǎng)的30d齡果蠅為衰老給藥組，以代謝組學(xué)的研究方法結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析黃芩對(duì)果蠅體內(nèi)代謝物的調(diào)節(jié)作用。最后對(duì)黃芩可調(diào)節(jié)的果蠅體內(nèi)代謝

9、通路進(jìn)行富集。
　　結(jié)果：
　　1.果蠅代謝輪廓分析結(jié)果顯示雌雄果蠅代謝輪廓在3d、15d、30d、45d的變化情況不同。PCA及PLS-DA分析均表明：雌性果蠅3d、15d、30d、45d的代謝輪廓彼此分開(kāi)，可見(jiàn)從3d到45d一直在發(fā)生顯著變化；而雄性果蠅代謝輪廓30d和45d彼此靠近并和3d、15d彼此分離，可見(jiàn)雄性果蠅代謝輪廓從3d到15d再到30d一直在明顯的改變，但是30d到45d時(shí)代謝輪廓的變化就不再明顯，這可能

10、是由于雄性果蠅在30d已經(jīng)進(jìn)入衰老階段所致。
　　果蠅代謝物變化情況分析結(jié)果顯示雌雄果蠅之間代謝物在3d、15d、30d、45d的變化情況的部分異同點(diǎn)如下：（1）雌雄果蠅之間部分代謝物（如：甲硫氨酸、葡糖糖等）隨年齡變化的變化趨勢(shì)完全一致，僅僅是代謝物含量在雌雄果蠅之間有差異（雌雄果蠅相同點(diǎn)）；（2）在雌性果蠅部分代謝物中（如：異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、酪氨酸等）從3d到30d存在著一個(gè)含量的上升或持平階段，但在雄性果蠅中則不存在

11、這樣的現(xiàn)象（雌雄果蠅不同點(diǎn)）；（3）幾乎所有的代謝物同一生命階段在雌雄果蠅之間都存在著含量的差異，并且大部分表現(xiàn)出在雄性顯著低于雌性（雌雄怎樣的不同）。
　　通過(guò)對(duì)雌雄果蠅綜合分析發(fā)現(xiàn)，與衰老相關(guān)的代謝標(biāo)志物包括：isoleucine, valine, alanine, glutamine, succinate, methionine, glycine, cysteine, tyrosine, tryptophan, phenyl

12、alanine, histidine, xanthine和 DMA。其主要涉及到的代謝通路有：氨基酸的合成及代謝、三羧酸循環(huán)及嘌呤代謝等。除此之外部分代謝物的變化還暗示著衰老過(guò)程伴隨著線粒體功能的紊亂。
　　2.雌雄果蠅代謝組學(xué)研究表明雌雄果蠅代謝輪廓在3d、15d、30d、45d這四個(gè)代表性的生命階段均存在顯著差異。找到了果蠅與衰老過(guò)程性別差異相關(guān)的代謝標(biāo)志物包括：isoleucine, valine, methionine,

13、phenylalanine, cysteine, succinate和DMA。主要涉及到的代謝通路有氨基酸的生物合成及代謝和三羧酸循環(huán)等途徑。除此之外部分代謝物含量在雌雄果蠅之間的差異還暗示著果蠅線粒體功能存在的性別差異。
　　3.果蠅壽命實(shí)驗(yàn)表明黃芩提取物能夠同時(shí)延長(zhǎng)果蠅（雌性和雄性兩種性別）的平均壽命和最高壽命，其中黃芩提取物1g/L和5g/L給藥組能夠顯著延長(zhǎng)雌性果蠅的平均壽命和最高壽命，黃芩提取物5g/L給藥組能夠顯著延長(zhǎng)

14、雄性果蠅的平均壽命和最高壽命。代謝組學(xué)的研究結(jié)果表明黃芩能夠調(diào)節(jié)衰老果蠅體內(nèi)isoleucine, valine, acetate, glutamine, phenylalanine, cysteine, glycine, succinate, lactate和glucose等代謝物的含量，并可能改善線粒體功能損傷進(jìn)而發(fā)揮延長(zhǎng)壽命的藥理活性。
　　結(jié)論：
　　1.果蠅代謝組學(xué)研究表明衰老過(guò)程中雌雄果蠅代謝輪廓及代謝物的變化規(guī)

15、律有所不同。雄性果蠅可能在30d就進(jìn)入衰老狀態(tài)，而雌性果蠅可能要更晚。通過(guò)代謝組學(xué)研究結(jié)合雌雄果蠅兩種性別更加全面的篩選出了14個(gè)衰老相關(guān)代謝標(biāo)志物及衰老相關(guān)代謝通路。
　　2.本研究采用代謝組學(xué)研究方法及多元統(tǒng)計(jì)分析方法篩選出7個(gè)與衰老過(guò)程性別差異相關(guān)的代謝標(biāo)志物及相關(guān)的代謝通路，這為衰老過(guò)程性別差異相關(guān)的進(jìn)一步研究提供了有效地研究思路和方向。
　　3.黃芩提取物能夠顯著延長(zhǎng)果蠅（雌性和雄性兩種性別）的平均壽命和最高壽命，