JAK-STAT通路在1-磷酸鞘氨醇后適應(yīng)減輕心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷中的作用.pdf

1、目的：
　　研究Janus激酶及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子（JAK-STAT）信號(hào)通路在1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）后適應(yīng)減輕H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷中的作用以及保護(hù)機(jī)制。
　　方法：
　　1.大鼠H9c2心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧模型的建立：
　　培養(yǎng)H9c2細(xì)胞需用含有10％ FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，正常培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液傾掉，換用缺氧液，在缺氧裝置中

2、缺氧培養(yǎng)16 h，之后換成無(wú)FBS的DMEM培養(yǎng)基，復(fù)氧條件下培養(yǎng)4 h。
　　2.將大鼠H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為7組：
　?。?）正常對(duì)照組（C組）；（2）缺氧/復(fù)氧（H/R）組；（3）S1P組；（4） S1P+AG組；（5）AG組；（6）S1P+ST組；（7）ST組。C組在正常培養(yǎng)后，換成無(wú)FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基；H/R組在缺氧裝置中用缺氧液培養(yǎng)16 h，然后換成DMEM培養(yǎng)基復(fù)氧培養(yǎng)4 h；S1P組在復(fù)氧時(shí)加入終濃

3、度為4μM的S1P的DMEM培基培養(yǎng)4 h；S1P+AG組在復(fù)氧前30 min時(shí)先加入終濃度為20μM的AG490（JAK2抑制劑）預(yù)處理，之后再換成含AG490和S1P的DMEM培基復(fù)氧培養(yǎng)4 h；AG組在復(fù)氧時(shí)加入20μM的AG490復(fù)氧培養(yǎng)4 h；S1P+ST組復(fù)氧前30 min時(shí)先加入終濃度為1μM的stattic（STAT3抑制劑）預(yù)處理，之后再換成含stattic和S1P的DMEM培基復(fù)氧培養(yǎng)4 h；ST組在復(fù)氧時(shí)加入1μM

4、stattic復(fù)氧培養(yǎng)4 h。
　　3.測(cè)定指標(biāo)：
　　1)通過(guò)MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率；
　　2)用微板法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中總超氧化物歧化酶（T-SOD）和錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）活力；
　　3)檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）活力；
　　4)通過(guò)JC-1檢測(cè)線粒體膜電位；
　　5)用Fluo-3 AM探針標(biāo)記細(xì)胞鈣離子，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)鈣離子熒光強(qiáng)度；
　　6)采用Ann

5、exin V-FITC/PI雙染法，流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞凋亡率；
　　7)采用caspase3試劑盒和酶標(biāo)法檢測(cè)各組細(xì)胞中caspase3活力；
　　8)Western Blot法分析各組細(xì)胞JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平和總蛋白的表達(dá)水平。
　　9)利用細(xì)胞線粒體分離試劑盒和Western Blot法測(cè)定各組中胞漿細(xì)胞色素C和線粒體中細(xì)胞色素C含量。
　　結(jié)果：
　　1. MTT測(cè)定細(xì)胞存活率

6、r>　　與C組相比，H/R組細(xì)胞存活率明顯降低。S1P處理后，細(xì)胞存活率顯著提高。而AG490或stattic后可抑制S1P升高細(xì)胞存活率作用。
　　2.細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活力
　　經(jīng)H/R處理，細(xì)胞培養(yǎng)液中的T-SOD及Mn-SOD活力與C組相比明顯下降。S1P可明顯提高T-SOD及Mn-SOD活力， AG490或stattic預(yù)處理可減弱S1P對(duì)T-SOD及Mn-SOD活力的升高作用。
　　3.細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活

7、力
　　缺氧復(fù)氧處理可明顯增加細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力，與C組比較有顯著性差異。而S1P可明顯降低缺氧復(fù)氧損傷時(shí)增加的LDH活力。AG490或stattic預(yù)處理可抑制S1P對(duì)LDH活力的降低作用。
　　4. JC-1檢測(cè)線粒體膜電位變化
　　與C組相比，H/R組可顯著增加綠/紅熒光比值，表明H/R損傷可使線粒體膜電位明顯降低；S1P處理使H/R組增加的綠/紅熒光比值明顯降低。加入AG490或stattic后，S1P組

8、升高綠/紅熒光比值的作用得到明顯抑制。
　　5.激光共聚焦顯微鏡測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子
　　鈣離子的熒光強(qiáng)度維持在8.895?1.079水平，經(jīng)過(guò)H/R損傷后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，與C組相比，有顯著性差異；經(jīng)過(guò)S1P處理后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度明顯降低；加入AG490以后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。同樣加入stattic后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度亦明顯增強(qiáng)。
　　6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率
　

9、　C組細(xì)胞凋亡率較低，與C組相比，H/R組細(xì)胞凋亡率顯著增加；經(jīng)過(guò)S1P處理后的細(xì)胞凋亡率，與H/R組相比顯著下降；與S1P組相比，加入AG490以后，細(xì)胞凋亡率明顯升高。同樣地，加入stattic以后，細(xì)胞凋亡率亦明顯增加，且與S1P組相比，有顯著性差異。
　　7.各組細(xì)胞caspase3活力的測(cè)定
　　與C組相比，H/R組細(xì)胞caspase3活力明顯增加。S1P處理后，caspase3活力顯著降低。AG490或statt

10、ic處理后可抑制S1P減弱caspase3活力的作用。
　　8.Western Blot法測(cè)定各組細(xì)胞蛋白表達(dá)變化
　　1) S1P、AG490對(duì)H/R損傷后H9c2細(xì)胞p-JAK2和t-JAK2蛋白表達(dá)的影響
　　與C組相比，H/R處理能使p-JAK2蛋白表達(dá)明顯增加；與H/R組相比，S1P組能明顯增加p-JAK2蛋白的表達(dá)；加入AG490后，S1P組增加p-JAK2蛋白表達(dá)量的作用被顯著抑制了。
　　2) S

11、1P、AG490對(duì)H/R損傷后H9c2細(xì)胞p-STAT3和t-STAT3蛋白表達(dá)的影響
　　H/R損傷后，p-STAT3蛋白表達(dá)量比C組有所增加；S1P給藥后，與H/R組比較，能明顯增加p-STAT3蛋白的表達(dá)；與S1P組相比， AG490處理能顯著抑制p-STAT3蛋白的表達(dá)。
　　3) S1P、stattic對(duì)H/R損傷后H9c2細(xì)胞p-STAT3和t-STAT3蛋白表達(dá)的影響
　　H/R損傷后，p-STAT3蛋白

12、表達(dá)量比C組有所增加；S1P給藥后，與H/R組比較，能明顯增加p-STAT3蛋白的表達(dá)；與S1P組相比， stattic處理能顯著抑制p-STAT3蛋白的表達(dá)。
　　9. Western Blot法測(cè)定胞漿和線粒體的細(xì)胞色素C含量
　　1) S1P、AG490和stattic對(duì)H/R損傷后H9c2細(xì)胞胞漿中的細(xì)胞色素C含量變化
　　與C組比較，H/R組胞漿細(xì)胞色素C水平明顯增加，S1P可明顯降低H/R損傷引起的胞漿細(xì)胞

13、色素C增加。AG490或stattic可明顯抑制S1P降低胞漿細(xì)胞色素C的作用。
　　2) S1P、AG490和stattic對(duì)H/R損傷后H9c2細(xì)胞線粒體中的細(xì)胞色素C含量變化
　　H/R組處理可使線粒體細(xì)胞色素C水平相比C組明顯降低，S1P可顯著抑制H/R損傷引起的線粒體細(xì)胞色素C降低。AG490或Stattic均可明顯抑制S1P增加線粒體細(xì)胞色素C的作用。
　　結(jié)論：
　　1. S1P能夠提高H9c2心肌

14、細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后的細(xì)胞存活率，增加細(xì)胞培養(yǎng)液中的T-SOD及Mn-SOD活性，減弱細(xì)胞培養(yǎng)液的LDH活力，降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度，減少線粒體膜電位下降和細(xì)胞凋亡，降低caspase3活性，并抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放，從而發(fā)揮保護(hù)作用。
　　2.本實(shí)驗(yàn)證明，S1P能夠顯著增加 H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后的 p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達(dá),給予JAK/STAT信號(hào)通路的抑制劑AG490或stattic后，S1P的保護(hù)