曲美他嗪促進AMPK依賴的自噬流減輕心肌細胞缺氧復氧損傷.pdf

1、研究目的:
　　觀察曲美他嗪(Trimetazidine，TMZ)預處理能否有效減輕心肌細胞缺氧/復氧(Hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷，并探索心肌細胞缺氧/復氧期間，曲美他嗪預處理是否經(jīng)過單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)通路調(diào)控自噬。
　　研究方法:
　　第一部分實驗:觀察H/R過程中曲美他嗪的保護作用，并確定最有效濃度。
　　

2、構建新生大鼠心肌細胞H/R模型，研究對象隨機分為對照組、H/R組、H/R+TMZ（10μM）組、H/R+TMZ(50μM)組、H/R+TMZ(100μM)組。采用MTS檢測細胞活性，收集培養(yǎng)液并通過試劑盒檢測LDH水平以觀察細胞損傷程度，比較各濃度療效，確定最有效濃度。
　　第二部分實驗:探明曲美他嗪對H/R過程中自噬的影響及干預自噬表達對曲美他嗪療效影響
　　本部分實驗主要采用氯喹(chloroquine，Cq)抑制自噬流

3、，實驗分組為對照組、對照+TMZ組、對照+Cq組、H/R組、H/R+TMZ組、H/R+Cq組、H/R+TMZ+Cq組。MTS檢測細胞活性，試劑盒檢測培養(yǎng)液LDH水平，并通過Western blot半定量分析自噬相關蛋白Beclin-1、LC3和p62的表達，轉(zhuǎn)染病毒mRFP-GFP-LC3并通過共聚焦顯微鏡以測定細胞自噬相關蛋白分布情況，透射電鏡直接觀察各組自噬體數(shù)量，TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡水平。
　　第三部分實驗:探明H

4、/R過程中干預AMPK對曲美他嗪所調(diào)控的自噬的影響
　　本部分實驗主要使用compound C(com C)抑制AMPK信號，實驗分組為對照組、對照+ com C組、H/R組、H/R+TMZ組、H/R+com C組、H/R+TMZ+ comC組。MTS檢測細胞活性，試劑盒檢測培養(yǎng)液LDH水平，最后通過Western blot半定量分析自噬相關蛋白LC3和p62及AMPK信號通路蛋白p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR的表

5、達。
　　研究結果:
　　1.曲美他嗪預處理減輕心肌細胞H/R損傷
　　與對照組相比，H/R組的細胞活性顯著性下降(P＜0.05);各曲美他嗪預處理組細胞活性均比H/R組高(P＜0.05)，H/R+TMZ(50μM)組細胞活性比H/R+TMZ(10μM)組高(P＜0.05)，但與H/R+TMZ(100μM)組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。因此50μM為曲美他嗪的最有效濃度。
　　2.曲美他嗪預處理在心肌細胞H/R

6、期間促進自噬流
　　H/R處理后各自噬相關蛋白均表達上調(diào)（P＜0.05，C vs.H/R組），然而曲美他嗪預處理后Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均進一步增強，p62減少(P＜0.05，H/Rvs.H/R+ TMZ組);透射電鏡結果顯示，相比對照組，HR組細胞漿內(nèi)出現(xiàn)更多自噬體，(P＜0.05);而相比H/R組，H/R+TMZ組自噬體數(shù)量進一步增加(P＜0.05)。共聚焦顯微鏡下，對照組無明顯LC3聚集現(xiàn)象;H/R處理

7、后，自噬體數(shù)量明顯增加(P＜0.05，Cvs.H/R組);與H/R組相比，H/R+TMZ組的自噬溶酶體更多(P＜0.05)。
　　3.Cq預處理抵消曲美他嗪對心肌細胞的保護作用
　　Cq預處理后，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62的表達均增加(P＜0.05，H/R+ TMZ vs.H/R+TMZ+Cq組);共聚焦顯微鏡下，Cq預處理顯著減少自噬溶酶體(P＜0.05，H/R+TMZ vs.H/R+ TMZ+ Cq組）;與H/R+T

8、MZ組相比，H/R+TMZ+Cq組細胞活性明顯下降(P＜0.05);
　　4.曲美他嗪預處理減少H/R中細胞凋亡
　　TUNEL染色結果顯示，與對照組相比，H/R組凋亡細胞顯著性增加(P＜0.05);曲美他嗪預處理后，凋亡細胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05，H/R vs.H/R+ TMZ組）;然而H/R+TMZ+Cq與H/R+ TMZ組相比，凋亡細胞顯著性增加(P＜0.05)。
　　5.曲美他嗪預處理通過AMPK-mTOR

9、調(diào)控H/R中的自噬
　　與H/R組相比，曲美他嗪預處理顯著增加p-AMPK/AMPK的比值以及減少p-mTOR/mTOR的比值（P＜0.05，H/R vs.H/R+ TMZ組）;與H/R+ TMZ組相比，compound C減少p-AMPK/AMPK比值，增加p-mTOR/mTOR比值(P＜0.05);此外，compound C減少LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值并增加了p62的表達;H/R+TMZ+com C與H/R+ TMZ組相比，