缺氧誘導(dǎo)因子1-α在大鼠原代心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧中的表達(dá)及其凋亡作用的研究.pdf

1、目的：
　　 缺氧/復(fù)氧損傷在心肌細(xì)胞中是一個極為復(fù)雜的過程，現(xiàn)已證明缺氧后復(fù)氧可以導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，細(xì)胞死亡既可以由壞死引起又可以是凋亡導(dǎo)致的。壞死是一個破壞性的不可控制的過程，而凋亡是一個高度調(diào)控的細(xì)胞自殺過程。在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中，凋亡是引起細(xì)胞死亡的一個非常重要的機制，這個機制也是非常復(fù)雜的，缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(HIF)在缺氧過程中可以調(diào)控一系列基因的表達(dá)，高達(dá)200種，這些基因能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞對缺氧或者缺血應(yīng)激時的反應(yīng)。

2、
　　 HIF是以異源二聚體的形式存在，由α和β亞單位組成。HIF-1α可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存與死亡，其可以通過調(diào)節(jié)血紅素加氧酶-1、一氧化氮合酶、環(huán)氧化酶-2和血管內(nèi)皮生長因子等進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞在缺血再灌注中的生存。同時，HIF-1α也可以激活促死亡調(diào)節(jié)基因，如Bcl-2蛋白家族的促凋亡蛋白Bnip3、BMF與死亡配體FasL。Bnip3是一種主要存在于線粒體的只含有BH3區(qū)域的蛋白，過量表達(dá)的Bnip3可以激活Bax/Bak，進(jìn)而引

3、起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Bnip3在缺血再灌注時線粒體的功能失調(diào)起著至關(guān)重要的作用。然而，HIF-1α在不同類型細(xì)胞及不同環(huán)境中的調(diào)節(jié)凋亡的作用仍然存在著爭議。
　　 本實驗主要研究在大鼠原代心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧過程中HIF-1α的作用并進(jìn)一步探討其主要機制。我們將大鼠原代心肌細(xì)胞分別給予正常氧、缺氧5小時、缺氧5小時復(fù)氧2小時、缺氧5小時復(fù)氧6小時及缺氧5小時復(fù)氧12小時來觀察HIF-1α的表達(dá)情況及凋亡程

4、度。采用小RNA干擾技術(shù)來抑制HIF-1α的表達(dá)并觀察HIF-1α對凋亡的影響。
　　 方法：
　　 一、大鼠原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)
　　 1～2d齡SD乳鼠，雌雄不限，將乳鼠用75％的酒精進(jìn)行消毒，取出心臟，放入不含有鈣鎂離子的PBS中，用滴管沖洗心臟，剝離心房及其主動脈，棄去PBS液，用剪刀將心臟剪成1mm3的組織塊，放入約7.5毫升的0.2％的Ⅱ型膠原酶，共消化4次，每次10-15分鐘。被消化下來的心肌細(xì)胞，放

5、入離心機中，以300g離心并將獲得的細(xì)胞種植在25cm2的培養(yǎng)瓶中，放入37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60分鐘。采取差速貼壁法純化心肌細(xì)胞，將未貼壁生長的心肌細(xì)胞收集并種植在6或24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。心肌細(xì)胞是用含有10％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。在培養(yǎng)的前48小時在培養(yǎng)基中加入100mmol/LbrdU來抑制非心肌細(xì)胞的增殖。采用這種方法培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞可以用抗β-肌球蛋白重鏈單克隆抗體通過免疫熒光的方法來檢測，心肌細(xì)胞純度可

6、達(dá)90-95％。心肌細(xì)胞培養(yǎng)48小時后換用含有10％的胎牛血清、不含BrdU的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，所有的實驗及檢測都在細(xì)胞培養(yǎng)48小時后進(jìn)行。
　　 二、原代心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷
　　 為了模仿缺氧環(huán)境，心肌細(xì)胞在正常培養(yǎng)48小時后將培養(yǎng)基換成配好的Tyrode's溶液(mmol/L: NaCl136.9,KCl2.68, Na2HPO4·12 H2O8.1,KH2PO41.47,CaCl20.9，MgCl2·6 H2

7、O0.49; pH7.2)，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到5％CO2、95％ N2缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5小時。將缺氧培養(yǎng)5小時的細(xì)胞的培養(yǎng)基再次換成含有10％的胎牛血清的DMEM的培養(yǎng)基，放到37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2、6與12小時。對照空白組的細(xì)胞始終培養(yǎng)在21％O2，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。最后將細(xì)胞分別收集進(jìn)行下一步實驗。
　　 三、HIF-1α的siRNA轉(zhuǎn)染
　　 心肌細(xì)胞被種植在六孔板中，培養(yǎng)2天后細(xì)胞融合率達(dá)到

8、約70-80％。分別將干擾HIF-1α的siRNA（100mmol/L）與沒有干擾作用作為陰性對照的siRNA(100mmol/L)轉(zhuǎn)染到心肌細(xì)胞中，使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑嚴(yán)格按照生產(chǎn)商提供的步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分成3組:非轉(zhuǎn)染組、陰性對照siRNA組與siRNA轉(zhuǎn)染組。非轉(zhuǎn)染組細(xì)胞是沒有被轉(zhuǎn)染siRNA的心肌細(xì)胞，陰性對照siRNA組細(xì)胞是轉(zhuǎn)染無干擾作用的siRNA，siRNA組細(xì)胞是轉(zhuǎn)染具有干擾作用的siRNA

9、。每組細(xì)胞都將給予正常氧，缺氧5小時以及缺氧5小時復(fù)氧6小時的處理。最后將細(xì)胞分別收集備用于以后的實驗。
　　 四、總RNA的提取及實時定量PCR反應(yīng)
　　 使用Qiagen Rneasy試劑按照說明書，提取已收集的心肌細(xì)胞的總RNA。經(jīng)過分光度計檢測，OD260/280≥1.8以及無明顯降解的RNA樣本，用于Real-Time PCR。使用TaKaRa SYBR PrimeScript RT PCR Two-Step試

10、劑盒，按照說明書進(jìn)行Real-Time PCR檢測，應(yīng)用Comparative Delta-delta Ct法進(jìn)行相對定量分析。用體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的磷酸甘油醛脫氫酶作為內(nèi)參來評估m(xù)RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
　　 五、Western Blot分析
　　 用Western Blot的方法對細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白的半定量分析。用抗HIF-1α，Bnip3，β-actin(Santa Cruz)以及激活型的caspase-3抗體，用含

11、有5％的脫脂奶粉的TBST溶液以1∶1000的濃度稀釋，4℃孵育過夜。二抗以1∶2000的濃度稀釋，使用加強化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)按照說明書操作就可以使蛋白顯影了。
　　 六、流式細(xì)胞儀凋亡分析
　　 采用Annexin V-FITC雙染凋亡檢測試劑盒(KeyGEN)來分析各組心肌細(xì)胞中的凋亡情況，按照說明書進(jìn)行實驗。簡單的說，每組心肌細(xì)胞收集約10，000個，加入雙染試劑后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。
　　 結(jié)果：
　　

12、 一、缺氧/再給氧引起HIF-1α的表達(dá)增加以及心肌細(xì)胞的凋亡
　　 為了檢測在缺氧/復(fù)氧的過程中，HIF-1α的表達(dá)以及心肌細(xì)胞凋亡的情況，將心肌細(xì)胞分成5組:正常氧組，缺氧5小時，缺氧5小時復(fù)氧2小時，缺氧5小時復(fù)氧6小時和缺氧5小時復(fù)氧12小時。我們的結(jié)果顯示缺氧5小時組HIF-1α的表達(dá)以及心肌細(xì)胞凋亡率與正常組相比顯著增加，同時我們發(fā)現(xiàn)缺氧5小時復(fù)氧2小時組HIF-1α的表達(dá)以及心肌細(xì)胞凋亡率與缺氧5小時組相比顯著增

13、加，缺氧5小時復(fù)氧6小時組的HIF-1α的表達(dá)以及心肌細(xì)胞凋亡率是所有時間點中最高的。這些數(shù)據(jù)給了我們一些提示，在缺氧/復(fù)氧損傷中HIF-1α在心肌細(xì)胞凋亡的過程中可能起著重要的作用。
　　 二、Bnip3增加的變化趨勢與HIF-1α的變化相同
　　 為了檢測Bnip3的變化，細(xì)胞仍分為5組:正常氧組，缺氧5小時，缺氧5小時復(fù)氧2小時，缺氧5小時復(fù)氧6小時和缺氧5小時復(fù)氧12小時。缺氧再給氧組Bnip3的mRNA及蛋白表

14、達(dá)與單獨缺氧組相比顯著增多，在缺氧5小時復(fù)氧6小時組Bnip3的mRNA及蛋白表達(dá)量達(dá)到最高值，這種變化與HIF-1α的變化相似。綜合上述結(jié)果，我們提出了在缺氧復(fù)氧引起的心肌細(xì)胞凋亡的過程中HIF-1α與Bnip3存在著一定的聯(lián)系。
　　 三、用siRNA抑制HIF-1α的表達(dá)可以減輕缺氧5小時復(fù)氧6小時心肌細(xì)胞的凋亡
　　 如果HIF-1α在缺氧5小時復(fù)氧6小時能夠引起心肌細(xì)胞凋亡，那么使用siRNA來抑制HIF-1α

15、的表達(dá)有可能減少心肌細(xì)胞的凋亡。結(jié)果顯示siRNA干擾組缺氧5小時復(fù)氧6小時HIF-1α的mRNA和蛋白的表達(dá)與陰性對照和非轉(zhuǎn)染組相比顯著降低，與非干擾組正常氧相比仍然增加。HIF-1α的表達(dá)可以被siRNA抑制，siRNA干擾組在缺氧5小時復(fù)氧6小時時凋亡的心肌細(xì)胞與陰性對照組和非轉(zhuǎn)染組相比顯著減少。然而，siRNA干擾組在缺氧5小時復(fù)氧6小時時凋亡的心肌細(xì)胞數(shù)仍然多于非干擾組正常氧時凋亡的心肌細(xì)胞數(shù)。這些結(jié)果顯示了siRNA在缺氧5

16、小時復(fù)氧6小時能夠減少凋亡的心肌細(xì)胞，在缺氧及復(fù)氧時siRNA可以干擾HIF-1α的表達(dá)。
　　 四、siRNA抑制HIF-1α的表達(dá)可以減少caspase-3的表達(dá)
　　 心肌細(xì)胞的凋亡可以由凋亡的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）觸發(fā)。在非轉(zhuǎn)染組中缺氧5小時復(fù)氧6小時caspase-3的mRNA表達(dá)量與缺氧5小時相比明顯增多。被切割的caspase-3是caspase-3的激活形式，在非轉(zhuǎn)染組中缺氧5小時復(fù)氧6

17、小時激活的caspase-3蛋白的含量與缺氧5小時相比明顯增多。然而，用siRNA抑制HIF-1α的表達(dá)，在缺氧5小時復(fù)氧6小時時caspase-3的表達(dá)與非轉(zhuǎn)染組和陰性對照轉(zhuǎn)染組相比明顯減少。
　　 五、siRNA抑制HIF-1α的表達(dá)可以減少Bnip3的表達(dá)
　　 我們發(fā)現(xiàn)siRNA抑制了HIF-1α的表達(dá)可以顯著缺氧5小時復(fù)氧6小時Bnip3的表達(dá)，與非轉(zhuǎn)染組及陰性對照組相比存在著顯著的差異。綜合以上的結(jié)果，我們可

18、以得出這樣的結(jié)論，通過siRNA來抑制HIF-1α的表達(dá)可以保護(hù)缺氧5小時復(fù)氧6小時的心肌細(xì)胞使其凋亡減輕，HIF-1α在缺氧復(fù)氧時所引起的細(xì)胞凋亡與Bnip3的激活有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 本次實驗我們通過培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞來觀察到缺氧后不同復(fù)氧時間細(xì)胞中的HIF-1α的mRNA及蛋白的表達(dá)增加，凋亡的心肌細(xì)胞數(shù)增多。這就說明了細(xì)胞在受到缺氧復(fù)氧損傷時表達(dá)增多的HIF-1α可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。我們采用siRNA干擾的

19、技術(shù)將沉默HIF-1α的siRNA轉(zhuǎn)染到心肌細(xì)胞中，結(jié)果證實了HIF-1α的表達(dá)被抑制了可以減少凋亡的心肌細(xì)胞，足以看出HIF-1α在細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中起到了重要的作用。
　　 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）是眾所周知的凋亡執(zhí)行酶，我們的實驗證實了在缺氧/復(fù)氧損傷中HIF-1α引起的凋亡是最終激活了凋亡執(zhí)行酶caspase-3。同時，實驗結(jié)果證實了Bnip3在缺氧復(fù)氧時的增多趨勢與HIF-1α的變化一致，而且