缺氧后適應(yīng)與心肌營養(yǎng)素-1對(duì)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧的保護(hù)作用及其機(jī)制.pdf

1、研究背景與目的:隨著生活水平的提高，心肌梗死發(fā)生率呈逐年上升的趨勢(shì)，經(jīng)過不斷的探索，心肌梗死的死亡率已明顯下降，尤其是冠脈介入的廣泛開展以后，但卻引起了缺血再灌注損傷如心肌細(xì)胞死亡、血流動(dòng)力學(xué)障礙、再灌注心律失常及內(nèi)皮功能障礙等發(fā)生率的增加。
　　 心肌細(xì)胞遭受缺血再灌注損傷后將發(fā)生一系列病理改變，出現(xiàn)細(xì)胞代謝紊亂和功能障礙。首先，心肌細(xì)胞鈉鉀ATP酶受損，鈉離子在細(xì)胞內(nèi)積聚，由于滲透壓的作用導(dǎo)致細(xì)胞外液向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，發(fā)生細(xì)胞水

2、腫、腫脹。病變進(jìn)展將逐漸出現(xiàn)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜的完整性遭到破壞，由可逆性損傷向不可逆損傷轉(zhuǎn)化。心肌細(xì)胞受到缺血再灌注損傷的同時(shí)，微血管內(nèi)皮細(xì)胞同樣受到損傷，擴(kuò)血管物質(zhì)減少縮血管物質(zhì)增加，血小板及白細(xì)胞吸附于血管壁導(dǎo)致微血管阻塞，出現(xiàn)微血管水平無灌注現(xiàn)象。
　　 根據(jù)已有的研究，目前認(rèn)為缺血再灌注損傷的主要機(jī)制為細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過多的自由基和細(xì)胞內(nèi)鈣超載。心肌細(xì)胞缺血時(shí)，線粒體氧化磷酸化功能障礙，使得線粒體氧化磷酸化途

3、徑減弱而生成氧自由基過程加強(qiáng)，同時(shí)氧自由基清除劑又因缺氧而活性降低，最終產(chǎn)生大量活性氧自由基。除此之外，中性粒細(xì)胞的“呼吸爆炸”及經(jīng)黃嘌呤氧化酶催化亦可產(chǎn)生氧自由基。氧自由基具有活潑的反應(yīng)性，能夠與膜磷脂、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。細(xì)胞缺氧導(dǎo)致各種離子轉(zhuǎn)運(yùn)泵功能障礙，細(xì)胞膜通透性增加，鈣離子在細(xì)胞內(nèi)聚集，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度明顯增加后可激活鈣依賴蛋白酶、蛋白水解酶、磷脂酶等酶類，并可沉積于線粒體，加重細(xì)胞損傷。
　　 缺

4、血后適應(yīng)，即在心肌缺血再灌注的即刻對(duì)冠脈進(jìn)行短暫、重復(fù)的開通及再閉過程，隨后恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流[1]。研究表明，缺血后適應(yīng)可保護(hù)缺血再灌注損傷的心肌，在提高心肌細(xì)胞存活率、減少心肌細(xì)胞凋亡、降低心肌梗死面積[2-3]和改善內(nèi)皮細(xì)胞功能等方面起到一定的保護(hù)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，缺血后適應(yīng)可保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定、抑制再灌注心肌細(xì)胞氧自由基的產(chǎn)生、減少中性粒細(xì)胞的激活及聚集，減少微血管的病變，影響缺血再灌注損傷的各個(gè)環(huán)節(jié)，減少心肌細(xì)胞損傷。缺血

5、后適應(yīng)主要應(yīng)用在急性心肌梗死的PCI治療中，操作方法簡便，在臨床應(yīng)用以來，表現(xiàn)出了較好的臨床效果。Garcia等[4]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過后適應(yīng)治療能夠明顯降低心肌梗死后CK的峰值及CK-MB的比例，減少患者心肌梗死面積。缺血后適應(yīng)在基礎(chǔ)及臨床都顯示出較好的心肌保護(hù)作用，臨床證實(shí)具有一定的可行性、安全性及潛在作用。
　　 心肌營養(yǎng)素-1(Cardiotrophin-1，CT-1)是由Pennica[18]在1995年從小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液中

6、分離出來的，被分類于白介素-6(IL-6)及白血病抑制因子(LIF)細(xì)胞因子家族，化學(xué)結(jié)構(gòu)與白介素-6家族相似并且可以與gp130受體結(jié)合。在早期，CT-1只是作為心肌疾病診斷和判斷預(yù)后的標(biāo)志物，最近的研究發(fā)現(xiàn)在心肌損傷中它是一種重要的神經(jīng)激素，主要表達(dá)于心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞，骨骼肌、肝臟和神經(jīng)節(jié)等多種分化組織中亦有表達(dá)，可參與心臟生理調(diào)節(jié)過程，具有促進(jìn)細(xì)胞存活和心臟正常發(fā)育的作用。在大鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，心室肥厚的早期階段即出現(xiàn)CT-

7、1 mRNA表達(dá)增加，而且心肌肥厚后CT-1一直保持高水平表達(dá)[5]。López B[6]等通過研究發(fā)現(xiàn)，血漿CT-1水平與心力衰竭程度、左心室質(zhì)量指數(shù)呈正相關(guān)，與射血分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)，而且這些相關(guān)性獨(dú)立于很多錯(cuò)綜復(fù)雜的潛在影響因素，提示CT-1可作為評(píng)估心衰程度的指標(biāo)，進(jìn)一步的研究表明CT-1較N末端腦鈉肽原對(duì)C期心力衰竭患者的診斷靈敏度更高，測(cè)量血漿CT-1濃度可對(duì)C期心力衰竭患者提供額外的信息。
　　 以上的研究表明CT-1與

8、心室重構(gòu)密切相關(guān)，而Jin[7]等發(fā)現(xiàn)CT-1還對(duì)血流動(dòng)力學(xué)有一定影響。靜脈注射CT-1后大鼠會(huì)發(fā)生全身性低血壓，其機(jī)制為降低外周血管阻力，并且這種降血壓效應(yīng)呈劑量依賴性;CT-1降壓的同時(shí)可增加心排血量，改善心功能。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，CT-1在心肌梗死后的缺血心肌中表達(dá)明顯增加，提示CT-1具有抗心肌細(xì)胞死亡，促進(jìn)殘存心肌細(xì)胞存活及加快梗死區(qū)愈合的作用?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)CT-1能促進(jìn)新生大鼠心肌細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中存活，以上均表明CT-1對(duì)心

9、肌細(xì)胞缺血缺氧具有保護(hù)作用。
　　 心肌細(xì)胞遭受再灌注損傷后，線粒體通透性轉(zhuǎn)換通道（mitochondriaipermeabiiity transition pore，mPTP）通透性增高，促凋亡蛋白由線粒體釋放到細(xì)胞漿中[8]，導(dǎo)致細(xì)胞死亡一一凋亡或壞死[9]。后適應(yīng)可激活ERK1/2通路，使其下游的GSK-3β磷酸化而失去活性，提示ERK1/2信號(hào)通路的激活可抑制mPTP的開放，減少細(xì)胞凋亡及壞死。ERK1/2信號(hào)通路的激活

10、還可抑制BAD活性或促進(jìn)蛋白轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮保護(hù)作用[10]。CT-1具有心肌保護(hù)作用，但其具體的作用機(jī)制以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚需進(jìn)一步的研究來證實(shí)。
　　 本研究以H9C2心肌細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在離體情況下，以缺氧復(fù)氧模型模擬缺血再灌注損傷，以缺氧后適應(yīng)模型模擬缺血后適應(yīng)，將缺氧后適應(yīng)與CT-1兩種細(xì)胞保護(hù)措施聯(lián)合，通過觀察心肌細(xì)胞存活率、凋亡率、Bad mRNA表達(dá)量及磷酸化ERK1/2蛋白（p-ERK1/2蛋白）表達(dá)的變化，了解在缺

11、氧后適應(yīng)的基礎(chǔ)上聯(lián)合CT-1后對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。并應(yīng)用信號(hào)通路阻斷劑，阻斷信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)一步闡明CT-1和缺氧后適應(yīng)對(duì)缺氧復(fù)氧心肌保護(hù)作用的機(jī)制及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從微觀水平論述CT-1和缺氧后適應(yīng)如何通過信號(hào)通路激活保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧復(fù)氧損傷。
　　 材料:離體培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞株，H9C2心肌細(xì)胞株在含10％胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基和37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，復(fù)蘇細(xì)胞正常傳2、3代后，取指數(shù)生長期

12、的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 方法:將細(xì)胞分為6組，分別給予不同的處理。a.正常對(duì)照組:細(xì)胞用含10％新生牛血清的DMEM液正常培養(yǎng)，不經(jīng)任何處理。b.缺氧復(fù)氧組:缺氧，用pH6.8 D-Hanks液在缺氧培養(yǎng)箱(95％N2，5％CO2，37℃)培養(yǎng)3h;復(fù)氧，缺氧3h之后用把pH6.8 D-Hanks換成含10％新生牛血清DMEM液，在MCO-17AICO2培養(yǎng)箱(95％O2，5％CO2，37℃)復(fù)氧3h。c.缺氧復(fù)氧+缺氧后適應(yīng)組

13、:同(2)組，在復(fù)氧之前施加5 min復(fù)氧/5 min缺氧3個(gè)循環(huán)。d.缺氧復(fù)氧+缺氧后適應(yīng)+CT-1組:同缺氧復(fù)氧組，在缺氧3h后加入10ug/l心肌營養(yǎng)素-1，再施加5min復(fù)氧/5min缺氧3個(gè)循環(huán)，復(fù)氧3h。e.缺氧復(fù)氧+缺氧后適應(yīng)+CT-1+ERK抑制劑組:在缺氧完成前30min加入20umo1/l ERK抑制劑A6355，缺氧完成后加入10ug/l心肌營養(yǎng)素-1，再施加5min復(fù)氧/5min缺氧3個(gè)循環(huán)，復(fù)氧3h。f.缺氧復(fù)

14、氧+缺氧后適應(yīng)+CT-1+二甲基亞砜組:ERK抑制劑換為二甲基亞砜，其他同(e)。應(yīng)用MTS法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)及細(xì)胞凋亡率，采用Western Blot檢測(cè)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2和p-ERK1/2）的表達(dá)，Q-PCR技術(shù)檢測(cè)Bad mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:與對(duì)照組相比，缺氧復(fù)氧組、缺氧復(fù)氧+缺氧后適應(yīng)組、缺氧復(fù)氧+缺氧后適應(yīng)+CT-1組、缺氧復(fù)氧+缺氧后適應(yīng)+CT-1+ERK抑制劑組、缺氧復(fù)氧

15、+缺氧后適應(yīng)+CT-1+二甲基亞砜組的細(xì)胞存活率下降、凋亡率升高、BadmRNA表達(dá)量增加，P＜0.05，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)過缺氧后適應(yīng)處理后，較缺氧復(fù)氧組細(xì)胞存活率上升、凋亡率下降、p-ERK1/2蛋白表達(dá)量增加、Bad mRNA表達(dá)量減少，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在缺氧后適應(yīng)處理基礎(chǔ)上加入心肌營養(yǎng)素-1(CT-1)后，細(xì)胞存活率上升、凋亡率下降、p-ERK1/2蛋白表達(dá)量增加、Bad mRNA表達(dá)量減少，P＜0.05，

16、差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在缺氧復(fù)氧+缺氧后適應(yīng)+CT-1組中加入ERK抑制劑后，細(xì)胞存活率下降、凋亡率升高、p-ERK1/2蛋白表達(dá)量減少、Bad mRNA表達(dá)量增加，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于ERK抑制劑由二甲基亞砜溶解，而二甲基亞砜本身具有一定細(xì)胞毒性，將ERK抑制劑換為二甲基亞砜，與缺氧復(fù)氧+缺氧后適應(yīng)+CT-1組相比，細(xì)胞存活率、凋亡率、p-ERK1/2蛋白表達(dá)量、Bad mRNA表達(dá)量無明顯變化，P＞0.05。各組細(xì)胞