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文檔簡介
1、目的:在調(diào)節(jié)心肌能量代謝過程中,AMPKα2起著非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)擬建立H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(A/R)及去除細(xì)胞外Cl-的A/R(Cl--freeA/R)損傷模型,探討AMPKα2低表達(dá)在氯離子介導(dǎo)心肌細(xì)胞A/R損傷中的作用,以便進(jìn)一步研究心肌A/R損傷機(jī)制。
方法:運(yùn)用RNA干擾技術(shù),以pSuper.Retro為載體,構(gòu)建AMPKα2 shRNA重組質(zhì)粒。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo),建立AMPKα2正常表達(dá)和低表達(dá)的心肌細(xì)胞(H
2、9c2),Western Blot法測定AMPKα2的蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)分五組,每組重復(fù)6次:(1)正常對照組;(2)A/R組;(3)去除細(xì)胞外Cl-的A/R組(Cl--free A/R);(4)pSuper+C1--free A/R組;(5)pS-AMPKα2+Cl--free A/R。四唑鹽(MTT)法測定各組心肌細(xì)胞存活率;測定各組抗氧化物酶SOD、乳酸脫氫酶LDH、谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px的活性;流式細(xì)胞儀測定各組ROS水
3、平、線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡程度。
結(jié)果:1.經(jīng)過酶切鑒定及基因測序結(jié)果證實(shí):AMPKα2 shRNA干擾質(zhì)粒重組成功;2.Western Blot檢測表明:重組質(zhì)粒能有效下調(diào)H9c2中AMPKα2蛋白表達(dá);3.正常H9c2細(xì)胞經(jīng)A/R處理后損傷嚴(yán)重,去除細(xì)胞外Cl-的A/R組有明顯對抗A/R導(dǎo)致的細(xì)胞存活率、SOD、GSH-PX酶活性下降,對細(xì)胞起保護(hù)作用;而AMPK低表達(dá)組中Cl--free對細(xì)胞的保護(hù)作用明顯消失,細(xì)胞
4、存活率、SOD、GSH-PX酶活性、線粒體膜電位下降,細(xì)胞內(nèi)ROS含量、LDH活性升高,細(xì)胞凋亡程度明顯比Cl--free A/R組嚴(yán)重(P<0.01)。pSuper+Cl--free A/R組與Cl--free A/R組相比,各指標(biāo)無明顯差異(P>0.05)。
結(jié)論:AMPKα2參與了去除細(xì)胞外氯離子(Cl--free)對抗心肌急性缺氧/復(fù)氧損傷的作用,AMPKα2基因沉默使Cl--free在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧中的保護(hù)作
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