溶菌酶和重組大腸桿菌蛋白質(zhì)體外分子交聯(lián)的初步研究.pdf

1、蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)在生物體內(nèi)與許多重要的正常生理過(guò)程密切相關(guān).通過(guò)對(duì)核糖核酸酶A、溶菌酶和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)的氧化再折疊研究,高音等人首次發(fā)現(xiàn)在此過(guò)程中有二聚體或多聚體產(chǎn)生,同時(shí)使用蛋白質(zhì)化學(xué)研究方法對(duì)蛋白質(zhì)分子交聯(lián)的化學(xué)本質(zhì)進(jìn)行探討,鑒定出交聯(lián)的化學(xué)鍵有二硫鍵和異肽鍵,并且實(shí)驗(yàn)證實(shí)阻斷分子間二硫鍵的形成就能防止分子間異肽鍵的形成;與再折疊相反的去折疊實(shí)驗(yàn)也得到同樣的結(jié)論.由此,我們提出蛋白質(zhì)分子交聯(lián)機(jī)理的三步假說(shuō):1)蛋白質(zhì)構(gòu)

2、象包括二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變,2)形成分子間二硫鍵,3)分子間異肽鍵的形成.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示分子間二硫鍵的形成對(duì)分子間異肽鍵的形成起到極為有效的促進(jìn)作用,且證實(shí)除了相同的蛋白質(zhì)分子能交聯(lián),不同的蛋白質(zhì)也可以交聯(lián).為了完善和補(bǔ)充蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)三步假說(shuō),本實(shí)驗(yàn)首次以原核生物的硫氧還蛋白(thioredoxin,TRX)、核糖核酸酶HⅡ(RNase HⅡ)和溶菌酶(Lysozyme)作為實(shí)驗(yàn)材料.把PCR方法克隆的大腸桿菌硫氧還蛋白(TRX)基因和核糖

3、核酸酶HⅡ(RNase HⅡ)基因插入表達(dá)質(zhì)粒pTrcHisC,構(gòu)建重組蛋白質(zhì)表達(dá)體系;通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),應(yīng)用TALON固定化金屬親和層析樹(shù)脂純化出重組TRX和RNase HⅡ,將它們和溶菌酶通過(guò)熱誘導(dǎo)去折疊方法進(jìn)行體外蛋白質(zhì)分子交聯(lián)實(shí)驗(yàn);結(jié)果顯示,蛋白質(zhì)在其臨界溫度反應(yīng)時(shí),出現(xiàn)交聯(lián)二聚化和多聚化現(xiàn)象;這些蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)包括分子間二硫鍵和其他共價(jià)鍵(異肽鍵);在去折疊反應(yīng)體系中加入還原劑二硫蘇糖醇(DTT)后,不但沒(méi)有分子間二硫鍵