溶菌酶和重組大腸桿菌蛋白質體外分子交聯的初步研究.pdf

1、蛋白質分子間交聯在生物體內與許多重要的正常生理過程密切相關.通過對核糖核酸酶A、溶菌酶和蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)的氧化再折疊研究,高音等人首次發(fā)現在此過程中有二聚體或多聚體產生,同時使用蛋白質化學研究方法對蛋白質分子交聯的化學本質進行探討,鑒定出交聯的化學鍵有二硫鍵和異肽鍵,并且實驗證實阻斷分子間二硫鍵的形成就能防止分子間異肽鍵的形成;與再折疊相反的去折疊實驗也得到同樣的結論.由此,我們提出蛋白質分子交聯機理的三步假說:1)蛋白質構

2、象包括二級結構的改變,2)形成分子間二硫鍵,3)分子間異肽鍵的形成.實驗結果顯示分子間二硫鍵的形成對分子間異肽鍵的形成起到極為有效的促進作用,且證實除了相同的蛋白質分子能交聯,不同的蛋白質也可以交聯.為了完善和補充蛋白質分子間交聯三步假說,本實驗首次以原核生物的硫氧還蛋白(thioredoxin,TRX)、核糖核酸酶HⅡ(RNase HⅡ)和溶菌酶(Lysozyme)作為實驗材料.把PCR方法克隆的大腸桿菌硫氧還蛋白(TRX)基因和核糖

3、核酸酶HⅡ(RNase HⅡ)基因插入表達質粒pTrcHisC,構建重組蛋白質表達體系;通過IPTG誘導表達,應用TALON固定化金屬親和層析樹脂純化出重組TRX和RNase HⅡ,將它們和溶菌酶通過熱誘導去折疊方法進行體外蛋白質分子交聯實驗;結果顯示,蛋白質在其臨界溫度反應時,出現交聯二聚化和多聚化現象;這些蛋白質分子間交聯包括分子間二硫鍵和其他共價鍵(異肽鍵);在去折疊反應體系中加入還原劑二硫蘇糖醇(DTT)后,不但沒有分子間二硫鍵