致腎盂腎炎大腸桿菌體外細胞粘附的初步研究.pdf

1、目的：建立正常人腎盂移行上皮原代細胞的培養(yǎng)方法，進行致腎盂腎炎大腸桿菌(pyelonephriticE.colioruropathogenicE.coli，UPEC)粘附特性的研究，并探討UPEC132毒力因子對宿主細胞的毒性作用。 方法：采用PCR及復(fù)合PCR方法分別擴增并檢測UPEC132的papC，hly及cnf1毒力基因。進行溶血試驗檢測UPEC132的溶血素。選擇正常人腎臟的腎盂組織進行原代細胞培養(yǎng)，分別比較兩種常用培

2、養(yǎng)方法及含血清培養(yǎng)基(RPMI1640等)與添加成分的無血清培養(yǎng)基(KSFM等)的不同培養(yǎng)基體系的培養(yǎng)結(jié)果，進行顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察、計數(shù)、HE染色、鑒定及成功率和污染率的統(tǒng)計，確定原代培養(yǎng)體系。進行UPEC132的細菌粘附試驗，經(jīng)Giemsa染色運用顯微鏡攝影技術(shù)觀察UPEC132與正常人腎盂移行上皮原代細胞、二倍體細胞系(Vero)及人移行上皮癌細胞系(EJ)粘附后的形態(tài)學(xué)改變，計數(shù)并統(tǒng)計15至180分鐘不同時間段的粘附率及粘附指數(shù)，比

3、較UPEC對三種細胞的粘附特性及與宿主細胞的相互作用。試驗中以標(biāo)準(zhǔn)株UPECJ96為陽性對照，無菌毛代表株E.coliK-12p678-54為陰性對照。試驗數(shù)據(jù)運用SPSS軟件進行t檢驗，x2檢驗等統(tǒng)計學(xué)處理。 結(jié)果：凝膠電泳結(jié)果顯示UPEC132的papC，hly和cnf1基因片斷擴增均為陽性。UPEC132溶血試驗為陽性。經(jīng)x2檢驗KSFM培養(yǎng)基體系原代培養(yǎng)的成功率高于RPMI1640培養(yǎng)基體系(P＜0.05)，組織塊法原代

4、培養(yǎng)的成功率高于酶消化法(P＜0.01)。鏡下觀察原代細胞形態(tài)為扁平不規(guī)則多角形，彼此緊密連接成片生長，呈典型的“鋪路石”狀，符合移行上皮細胞形態(tài)。原代細胞經(jīng)角蛋白抗體免疫細胞化學(xué)染色呈陽性，鑒定為移行上皮細胞。UPEC132與三種細胞粘附試驗的粘附率及粘附指數(shù)均在30分鐘趨于穩(wěn)定，此時間段的三組均數(shù)分別為68.00與20.27，45.60與16.55，69.60與32.28。UPEC132與細胞粘附后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，油鏡下觀察

5、細胞收縮、連接松散、可見胞內(nèi)空泡樣變、胞漿突起減少或消失。UPEC132有的粘附于細胞表面、細胞膜沿菌體向內(nèi)凹陷，有的則出現(xiàn)于胞漿及胞核內(nèi)。而無菌毛代表株E.coliK-12p678-54與三種細胞的粘附率及粘附指數(shù)均為0。 結(jié)論：UPEC132含有papC、hly、cnf1毒力基因。采用組織塊法及KSFM培養(yǎng)基(添加EGF及BPE)可以成功培養(yǎng)出正常人腎盂移行上皮原代細胞。UPEC132與上述三種細胞均發(fā)生粘附，在30分鐘內(nèi)基