不同來源微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立及生物學(xué)特性比較.pdf

1、目的：分離小鼠脂肪微血管內(nèi)皮細(xì)胞（AMECs）及肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（PMECs），建立微血管內(nèi)皮細(xì)胞（MECs）的培養(yǎng)方法。比較兩種MECs生物學(xué)特性的差別。為我們下一步研究MECs對(duì)造血干細(xì)胞（HSCs)體外擴(kuò)增的影響奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也給MECs的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法：
　　1、微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的建立：（1）提取C57小鼠的附睪旁脂肪組織和肺組織，用0.1％I型膠原酶在37℃條件下?lián)u床消化，用7

2、0um濾器過濾細(xì)胞懸液。（2）尋找分離附睪旁脂肪組織的最佳鼠齡，分組：①4w，②6w，③8w，④10w，判斷標(biāo)準(zhǔn)：每ml脂肪組織所含種子細(xì)胞數(shù)量。（3）探索最佳首次換液的時(shí)間，分組：①24h，②48h，③72h，判斷標(biāo)準(zhǔn)：能否獲得原代MECs。（4）尋找原代培養(yǎng)的最佳接種密度，分組：①5×105/cm2，②1×106/cm2，③2×106/cm2，判斷標(biāo)準(zhǔn)：培養(yǎng)至第8天的細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量。（5）探索明膠包被培養(yǎng)皿的最適宜濃度，分組：①0，

3、②0.1%，③0.5%，④1%，判斷標(biāo)準(zhǔn)：收獲的原代MECs細(xì)胞數(shù)。
　　2、對(duì)AMECs與PMECs的生物學(xué)特性進(jìn)行比較：（1）比較平均每只小鼠獲得的脂肪微血管內(nèi)皮細(xì)胞（AMECs）和肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（PMECs）數(shù)量。（2）倒置顯微鏡觀察AMECs及PMECs的生長、形態(tài)變化。（3）流式細(xì)胞分析技術(shù)及免疫熒光技術(shù)測(cè)得AMECs和PMECs的CD31、CD34、CD45、vWF的表達(dá)。（4）繪制生長曲線比較AMECs和PMECs

4、的增殖能力。（5）將獲得的原代AMECs和PMECs按3:1進(jìn)行傳代，比較兩種細(xì)胞的傳代能力及傳代細(xì)胞形態(tài)。（6）采用10ng/mlVEGF培養(yǎng)兩種MECs觀察形態(tài)特征。
　　結(jié)果：
　　1.微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)的最佳方法：（1）采用酶消法能夠成功分離兩種組織獲得種子細(xì)胞。（2）4周齡小鼠單位體積脂肪獲得的種子細(xì)胞數(shù)為4.67±0.58（106），6周組為10.18±0.28（106），8周組為9.94±0.35（106）

5、，10周組為6.72±0.39（106）；6周組及8周組較4周組、10周組多（P<0.05）,6周組與8周組比較無差異(P>0.05）。（3）24h首次換液可獲得原代AMECs和PMECs；48h及72h首次換液，雜細(xì)胞生長占優(yōu)勢(shì)，無法獲得原代MECs。（4）1×106/cm2為原代最佳接種密度；5×105/cm2細(xì)胞稀疏，MECs增殖不良；2×106/cm2細(xì)胞接觸抑制，死亡脫壁。（5）培養(yǎng)至第8天，AMECs的未包被明膠組的200×

6、鏡下細(xì)胞數(shù)為148.33±13.54，0.1%組為201.83±12.97，0.5%組為191.50±11.52，1%組為193.00±8.67；明膠包被的3組得到的AMECs多于未包被組（P<0.05）,而3種濃度間無差異（P>0.05）。培養(yǎng)至第10天， PMECs的未包被明膠組的200×鏡下細(xì)胞數(shù)為182.33±11.03，0.1%組為219.50±11.4，0.5%組為212.00±12.39，1%組為213.00±12.12；

7、明膠包被的3組得到的PMECs多于未包被組（P<0.05）,而3種濃度間無差異（P>0.05）。
　　2.AMECs與PMECs的生物學(xué)特性比較的結(jié)果：（1）原代培養(yǎng)的AMECs及PMECs均在第48h-72h形成細(xì)胞團(tuán)，第4天左右細(xì)胞呈多角形、卵圓形， AMECs在第10天、PMECs在第14天形成“鋪路石樣”改變，細(xì)胞表面可觀察到微絨毛。（2）每只小鼠獲得的AMECs種子細(xì)胞為2.08±0.57（×106）， PMECs種子細(xì)

8、胞為19.07±0.72（×106），二者有差異(P<0.05)。每只小鼠獲得的AMECs原代細(xì)胞數(shù)為0.26±0.05（×106），PMECs原代細(xì)胞數(shù)為3.37±0.18（×106），二者有差異(P<0.05)。（3）AMECs及PMECs均不表達(dá)CD45。AMECs的CD31、CD34、vWF表達(dá)率分別為44.28%、30.15%、76.1%，PMECs的CD31、CD34、vWF表達(dá)率分別為45.8%、57.48%、81.39%

9、。（4）傳代的兩種細(xì)胞生長均快于原代細(xì)胞，與原代細(xì)胞形態(tài)相比無明顯差異。（5）生長曲線顯示PMECs緩慢增殖期較AMECs長；AMECs生長高峰為接種后3-6天，PMECs生長高峰為接種后4-7天。（6）10ng/mlVEGF培養(yǎng)兩種細(xì)胞，第6天可見細(xì)胞伸展、遷移融合形成細(xì)胞索，細(xì)胞索相互之間連接溝通。
　　結(jié)論：
　　1．本研究建立了經(jīng)濟(jì)有效、簡便、可重復(fù)的分離培養(yǎng)AMECs及PMECs的最佳方案：24h首次換液、1×10